利用基序引导的虚拟发现与斑马鱼谱系分析优先筛选神经活性配体

《npj Drug Discovery》：Prioritizing neuroactive ligands using motif-guided virtual discovery and zebrafish profiling

　　

超大规模化学文库的虚拟筛选是早期配体发现的一种高效策略。然而，这类流程通常会产生数千个通过计算过滤的分子，而源自计算机模拟（in silico）的相互作用能并不能稳定预测实验效力。此外，许多高亲和力命中物并不一定能够在具有组织、屏障以及广泛脱靶可能性的生物体内有效发挥功能。本研究建立并应用了一条整合流程，通过结构引导计算与基于斑马鱼的功能谱系分析对候选分子进行优先级排序。研究人员引入了用于锚定配体的Rosetta基序引擎（Rosetta Engine for Anchoring Ligands with a Motif, REAL-M），这是一种利用蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）中的结构相互作用数据指导配体放置与筛选的筛选算法。以食欲素受体为测试案例，在基于细胞的报告检测中，30个预测拮抗剂中有28个可显著阻断其同源肽激动剂的结合，其中包括6个化学结构多样且效力可与既有拮抗剂相当的分子。在这6个分子中，有3个可显著缓解食欲素诱导的斑马鱼幼体活动过度。进一步结合斑马鱼hcrtr2缺失（null）突变体进行二级测试，证实这些行为表型属于靶点依赖性效应；相比之下，一种已获临床批准的拮抗剂则表现出脱靶表型。该流程可方便地推广至数千种具有高度保守结合口袋的斑马鱼蛋白。

该研究发表于《npj Drug Discovery》，围绕超大规模可合成化学空间中的配体发现效率与体内功能验证瓶颈，提出了一条从计算筛选到动物功能判定的整合式药物发现流程。现有经典分子对接高度依赖能量函数进行配体构象采样与结合评分，但预测亲和力与真实实验结果之间通常仅呈弱相关，且经过计算过滤后往往仍需人工审阅大量分子，限制了客观性、可扩展性与筛选效率。更关键的是，即便获得高亲和力候选物，也难以仅凭体外或计算结果判断其在完整生物体中是否具有足够效力、组织通透性以及可接受的脱靶风险。因此，研究人员开展本研究，旨在建立一种兼顾计算可扩展性、结构合理性与体内功能判定能力的新型筛选策略。

研究人员开发了基于Rosetta软件套件的用于锚定配体的Rosetta基序引擎（Rosetta Engine for Anchoring Ligands with a Motif, REAL-M）。该方法从蛋白质数据库（Protein Data Bank, PDB）中提取已知蛋白-配体相互作用几何信息，构建“基序（motif）”库，并用这些基序在目标受体结合口袋中引导候选配体的放置与筛选，从而减少对单一能量函数的依赖。研究以食欲素/下丘脑分泌素受体2（hypocretin receptor 2, HCRTR2）为验证模型，结合Enamine REAL文库进行超大规模虚拟筛选，再通过PRESTO-Tango G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor, GPCR）活性检测和斑马鱼行为学实验对候选物进行逐级验证。结果显示，该流程不仅在计算基准测试中表现优良，而且能够高效发现具有多样化化学骨架与结合模式的受体拮抗剂，并借助斑马鱼模型区分体内在靶效应与脱靶行为效应。这一研究的重要意义在于，为跨越“计算命中物”到“体内有效候选物”的关键转化鸿沟提供了可推广范式，尤其适用于人与斑马鱼之间结合口袋高度保守的大量蛋白靶标。

就主要技术方法而言，研究首先从221,799个蛋白-配体结构中提取相互作用基序，并利用Conformator生成Enamine 26亿分子的多构象库；随后借助体积对齐分子形状数据库（volumetric aligned molecular shapes database, VAMS ShapeDB）进行形状优先排序，并以REAL-M实施基序引导放置、快速网格冲突检测、高分辨率精修及应变/能量再筛选。方法学性能通过90个DUD-E蛋白-配体系统及既往对接研究命中物回收实验评估。实验验证方面，采用HTLA细胞中的PRESTO-Tango GPCR报告系统测定HCRTR2激动/拮抗活性；动物层面使用Tg（hsp70l:hcrt）过表达斑马鱼幼体评估行为学效应，并结合CRISPR/Cas9构建的hcrtr2^uab480失功能突变体判定在靶性与脱靶性。

在结果部分，论文首先以“REAL-M: a motif-guided screening approach”为题，系统介绍了REAL-M的算法核心。研究人员建立了独特的蛋白-配体相互作用几何“基序”库，每个基序由6个非氢原子组成，其中3个来自氨基酸残基、3个来自配体，并保留成键关系和空间排布。算法在预先指定的锚定残基处，利用与该氨基酸类型匹配的基序引导配体进入结合口袋。随后，仅保留通过能量阈值并具有额外基序样相互作用的复合物，以提高构象的天然样性。为适配超大规模文库，研究人员引入了超快速、基于网格的骨架碰撞检测：将蛋白与配体表示为1 ?分辨率的三维占据网格，一旦共享同一网格空间即放弃该构象。该步骤不仅排除严重位阻冲突，还评估配体对结合口袋的填充程度，剔除体积过小、难以形成足够有效接触的分子。之后再逐步施加吸引与排斥能过滤，并根据基序数目、构象应变与结合能综合优选，再以扩增至最多250个构象的集合重新对接与重评分。对90个DUD-E体系的比较显示，REAL-M在已知复合物回收能力上持续可比于或优于AutoDock Vina、Schr?dinger-Maestro Glide、DOCK 6及AlphaFold 3。对于既往基于Enamine文库的发表命中物，在将其与最多10,000个相似分子量分子混合后，89个已知命中物中有87个仍可被REAL-M作为优先候选重新识别，表明该方法在多靶标背景下具有较高的回收能力与泛化潜力。

在“Screening for modulators of the hypocretin receptor”部分，研究人员将HCRTR2选为验证对象，原因在于该受体在人与斑马鱼之间结构和功能高度保守，并已有活化态与非活化态结构可供利用。研究基于非活化态4S0V和活化态7L1U分别开展筛选，前者以ASN324为锚点，后者以在活化中上翻的GLN134为锚点。VAMS形状筛选输入分别使用截短的食欲素肽以及3种结构已知拮抗剂。对每个输入结构，研究人员都从346亿个构象中优先选出1200万个进入基序搜索。经多轮过滤与精修后，活化态模型获得162个潜在结合分子，非活化态模型获得137个潜在结合分子，最终选取95个分子委托合成，收到并测试82个。PRESTO-Tango检测表明，超过一半受试分子能够显著抑制orexin A肽与HCRTR2结合；其中，对接至4S0V非活化态的30个分子中有28个为显著拮抗剂，抑制率超过50%。对接至活化态7L1U的52个分子中，也有14个表现为有效拮抗剂，尽管它们被明确锚定于朝上的GLN134。最强的7个抑制剂中包含1个来自7L1U筛选，且其IC₅₀与商业可得分子相当。这些强效分子与既有激动剂或拮抗剂相比，展现出不同的残基相互作用谱和多样化结合模式。特别值得注意的是，来源于活化态筛选的分子5262表现为高亲和力拮抗剂。为验证其预测结合模式，研究人员进一步寻找删除关键相互作用原子的类似物，结果两个类似物均失去阻断肽结合的能力，从而支持了预测构象的可信性。另一方面，针对激动剂发现的补充筛选显示，即便稳定GLN134上翻取向，也只能得到极弱的受体激活，提示该构象变化对于激活是必要但不足条件。研究还针对含磺酰胺基团的分子在更大文库中开展定向筛选，又获得两个弱激动剂，进一步支持上述结论。

在“Assessment of efficacy and toxicity in animal models”部分，研究重点转向体内功能验证。研究人员首先在斑马鱼中利用热激诱导hcrt过表达模型建立活动过度表型。对体外筛得的7个最强拮抗剂进行行为学评估后发现，其中3个分子，即3547、6566和8519，能够缓解食欲素诱导的幼体过度活动，说明其不仅具备细胞层面的受体拮抗能力，也能在脊椎动物体内产生功能效应。随后，研究人员构建了hcrtr2^uab480失功能突变体，并在该背景下重新评估化合物效应，以检验行为改变是否确属在靶作用。结果显示，该纯合突变体本身对幼体行为无显著影响；然而，已获美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准的suvorexant以及商业拮抗剂SB-674042，即使在hcrtr2突变体中仍导致幼体活动显著下降，提示其存在明显且具有行为学相关性的脱靶作用。与之相对，大多数新发现分子在突变体中的影响较轻且不显著，支持其在hcrt过表达背景下所见行为救援主要源于对食欲素通路的特异调控。该部分结果凸显了斑马鱼遗传模型在早期药物发现中判别在靶活性、脱靶风险及潜在毒性的独特价值。

讨论部分强调，REAL-M通过将PDB来源的空间相互作用约束与Rosetta基于物理的能量函数相结合，在大幅提升筛选可扩展性的同时，改善了传统对接中对能量评分过度依赖的问题。快速冲突检测与基序后过滤使其能够在一次虚拟筛选中评估超过29亿个分子，同时有效减少“高分但不可信”构象的保留数量。研究也指出，REAL-M当前仍依赖功能相关的高质量受体结构，且在配体放置时假设受体主链相对刚性，因此对激动剂尤其是强激动剂的识别仍受限制。未来可通过引入结构集合、分子动力学（molecular dynamics, MD）生成构象、主链参与的基序以及双锚点策略进一步提升性能。论文还指出，若与AlphaFold2结构模型结合，REAL-M有望拓展至更广泛的人类蛋白组靶标。

关于斑马鱼平台，论文认为其在人类疾病相关蛋白和药物靶点层面具有高度保守性，尤其在GPCR结合口袋层面，165个受体的相似性可超过90%。因此，斑马鱼不仅可作为低成本、高通量的体内预筛选平台，还可通过突变体比较揭示意外的脱靶行为效应。由于每次行为实验所需化合物量很低，该系统尤其适合于小规模合成产物的快速优选。

研究结论可译述为：本研究提出了一种新的知识引导型虚拟配体筛选方法，并利用斑马鱼模型的独特优势对候选分子进行优先级排序。REAL-M在Rosetta框架内整合了已发表结构中的空间相互作用约束和基于物理的能量函数，在计算基准测试以及食欲素受体拮抗剂实验发现中均表现出很高成功率。斑马鱼行为学筛查进一步验证了预测配体的体内效力。整体而言，该研究建立了一种将高通量计算发现与快速体内验证相统一的工作蓝图，可用于面向斑马鱼与人类共享的多种蛋白靶标开展配体发现与优先筛选。