Dnmt3a介导的表观遗传机制在小鼠慢性疼痛诱导的负性情绪行为中的作用

《Cells》：A Dnmt3a-Mediated Epigenetic Mechanism for Chronic-Pain-Induced Behaviors of Negative Emotion in Mice

　　

慢性疼痛与相关负性情绪的共病会显著加重疼痛体验与疼痛慢性化，是一个严重的临床问题。尽管已有大量临床前与临床研究，疼痛?负性情绪共病的分子机制仍不清楚。本研究探讨慢性疼痛诱导负性情绪的表观遗传机制，聚焦DNA甲基转移酶3a(Dnmt3a)在慢性神经病理性疼痛小鼠中的作用。在作为外周向脑传递疼痛信号的脑干门户旁臂核(parabrachial nucleus, PBN)中，研究人员发现持续一个月的慢性疼痛诱导了焦虑样和抑郁样行为，并下调了Dnmt3a蛋白。过表达PBN Dnmt3a可使慢性疼痛小鼠免于产生这些负性情绪行为，而敲低PBN Dnmt3a足以在初始小鼠中诱导焦虑样行为。相反，慢性疼痛增加了PBN中谷氨酸AMPA受体GluA1?pSer831亚基的表达。Dnmt3a敲低同时增加了PBN GluA1?pSer831的表达及PBN神经元中AMPA受体的突触功能。过表达PBN GluA1在初始小鼠中诱导焦虑样行为，而敲低PBN GluA1产生抗焦虑效应并阻止慢性疼痛诱导的焦虑样行为。这些结果表明，Dnmt3a是通过PBN将慢性疼痛与负性情绪行为联系起来的关键表观遗传调节因子，PBN GluA1是此过程中Dnmt3a的重要调控靶点。

该研究发表于《Cells》。目前约10%的人群遭受慢性神经病理性疼痛，其在造成家庭与社会层面临床与经济负担的同时，常伴随焦虑、抑郁等心境障碍，负性情绪又会提高疼痛敏感性与慢性化风险，形成共病并严重损害生活质量。由于非阿片类策略有限，许多患者长期依赖阿片类药物，增加滥用与过量风险，因此阐明慢性疼痛?负性情绪共病的分子机制对新靶点与公共卫生意义重大。已有研究明确旁臂核(PBN)是传递疼痛情感成分的中继枢纽，其CGRP阳性神经元参与疼痛威胁记忆，PBN至中央杏仁核(CeA)投射可诱导大鼠焦虑抑郁行为，但PBN内参与该共病的细胞内信号机制尚不清楚。表观遗传调控尤其是DNA甲基化可在慢性病中起持久作用，DNA甲基转移酶Dnmt3a介导的从头甲基化在急性感觉疼痛维持与敏化中已有报道，但Dnmt3a依赖的DNA甲基化如何参与PBN传递慢性疼痛情感维度仍不明确，因此研究人员在慢性神经病理性疼痛小鼠模型中探索PBN Dnmt3a及其潜在调控靶点在慢性疼痛诱导负性情绪行为中的作用。

为开展研究，研究人员使用成年C57BL/6J小鼠与Dnmt3a^fl/fl小鼠，雌雄合并分析，随机分组并盲法评估，排除健康异常个体，遵循动物伦理。采用保留神经损伤(SNI)构建慢性神经病理性疼痛小鼠模型，假手术对照仅暴露坐骨神经而不结扎切断。通过机械痛阈值测试评估痛觉过敏，采用开场试验(OFT)、高架十字迷宫试验(EPMT)、强迫游泳试验(FST)分别检测焦虑样与抑郁样行为。应用Western blot与定量实时PCR(qRT?PCR)检测PBN中Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt1、GluA1?pSer⁸³¹、总GluA1、GluA2的蛋白与mRNA水平。使用腺相关病毒(AAV)在PBN局部过表达或敲低Dnmt3a与GluA1，借助立体定位注射并验证位点。通过全细胞膜片钳记录PBN神经元微小抑制性突触后电流(mIPSC)与AMPA/NMDA兴奋性突触后电流(EPSC)，分析AMPA突触功能。数据统计采用非配对双尾Student t检验、单因素与双因素ANOVA及Bonferroni事后检验，结果以均值±标准误表示，p<0.05为显著。

3.1. Chronic Pain Induces Behaviors of Negative Emotion with Decreased Dnmt3a in PBN

SNI术后小鼠出现长期机械性异常痛，痛阈值显著降低并持续至少一个月，证实慢性神经病理性疼痛模型成立。术后4周，SNI小鼠在OFT中中心区时间与距离减少，总路程无差异；EPMT中开放臂时间减少，总路程无差异；FST中不动时间增加，表明慢性疼痛诱导焦虑样与抑郁样负性情绪行为。Western blot与qRT?PCR显示，SNI后1周与4周PBN中Dnmt3a蛋白与mRNA显著下调，而Dnmt3b与Dnmt1蛋白无变化，提示PBN Dnnmt3a可能是参与负性情绪行为的主要表观遗传调节因子。

3.2. Overexpression of PBN Dnmt3a Relives Chronic-Pain-Induced Behaviors of Negative Emotion

研究人员在PBN双侧注射AAV?CMV?Dnmt3a过表达Dnmt3a，蛋白水平显著升高。过表达Dnmt3a不改变SNI诱导的机械痛阈下降，但在OFT与EPMT中不再出现焦虑样行为，FST中不动时间也无差异，且PBN Dnmt3a水平在SNI与假手术组间无差异，说明过表达PBN Dnmt3a可挽救慢性疼痛诱导的负性情绪行为但不影响伤害性超敏反应。

3.3. Knockdown of PBN Dnmt3a Induces Anxiety-like Behavior

在Dnmt3a^fl/fl小鼠PBN注射AAV?CaMKII?Cre敲低Dnmt3a，蛋白水平显著下降。敲低不影响基线机械痛阈值，但在OFT中中心区时间与距离减少、总路程无差异，诱导焦虑样行为，进一步证实PBN Dnmt3a下调足以引起焦虑样行为并参与慢性疼痛诱导的焦虑。

3.4. Dnmt3a Modulates Expression of GluA1 in PBN

SNI后1周与4周PBN中GluA1?pSer⁸³¹显著增加，总GluA1与GluA2无变化。在Dnmt3a敲低小鼠中，GluA1?pSer⁸³¹显著上调；而过表达Dnmt3a的慢性疼痛小鼠中SNI不再增加GluA1?pSer⁸³¹，表明Dnmt3a可调控PBN中活性GluA1?pSer⁸³¹表达，慢性疼痛通过降低Dnmt3a使其上调。

3.5. Knockdown of Dnmt3a Enhances AMPA Synaptic Function

全细胞膜片钳显示，Dnmt3a敲低后PBN神经元AMPA/NMDA EPSC比值显著升高，AMPA微小EPSC(mEPSC)振幅增大而频率不变，GABA_A受体介导的mIPSC振幅与频率均无变化，说明Dnmt3a敲低主要通过增强突触后AMPA受体功能提高兴奋性突触传递，而不影响GABA能抑制突触。

3.6. PBN GluA1 Mediates Anxiety-like Behavior

在初始小鼠PBN过表达GluA1使GluA1?pSer⁸³¹升高，OFT中出现焦虑样行为而总路程不变。敲低GluA1则GluA1?pSer⁸³¹下降，OFT中心区时间与距离增加，产生抗焦虑效应。在SNI小鼠中敲低PBN GluA1后，机械痛敏仍存在，但SNI不再诱导焦虑样行为，说明PBN GluA1是慢性疼痛诱导焦虑行为所必需的。

讨论部分总结指出，本研究从分子、细胞与行为层面证明PBN Dnmt3a是介导慢性神经损伤诱导负性情绪行为的重要调节蛋白，过表达Dnmt3a可克服神经损伤下调并挽救焦虑样行为，敲低Dnmt3a本身足以在初始状态诱导焦虑，模拟神经损伤效应。GluA1可能是PBN中Dnmt3a的潜在靶点，Dnmt3a敲低增加GluA1表达与AMPA突触功能，改变GluA1水平与焦虑呈正相关，过表达Dnmt3a抑制慢性疼痛引起的GluA1增加并减轻焦虑，敲低GluA1阻止慢性疼痛诱导的焦虑。这支持一种表观遗传机制：慢性疼痛下调Dnmt3a，上调GluA1并增强PBN中AMPA受体突触功能，通过激活PBN投射导致焦虑行为。Dnmt3a在情绪障碍中具脑区特异性，本研究发现长期慢性疼痛可降低PBN Dnmt3a，不同于应激等其他厌恶条件的变化。Dnmt3a可能直接或间接调控兴奋性谷氨酸能神经元中AMPA受体GluA1亚基表达，具体甲基化机制待究，未来可关注NR2B含NMDA受体作用及CeA等下游回路。值得注意的是，PBN Dnmt3a敲低不影响初始痛反应，过表达也不改善SNI伤害性超敏，与PBN?CeA通路主要介导负性情感行为而非基线痛反应一致。综上，PBN Dnmt3a是关键表观遗传调节因子，GluA1可能是其调控靶点，过表达PBN Dnmt3a与敲低GluA1可挽救焦虑行为，提示Dnmt3a有望作为未来治疗慢性疼痛与共情情绪障碍的分子靶点。

研究结论部分原文翻译如下：

在本研究中，研究人员提供了分子、细胞和行为证据，表明PBN中的Dnmt3a在介导小鼠慢性神经损伤诱导的负性情绪行为中具有重要作用。因此，局部过表达PBN Dnmt3a可以克服神经损伤诱导的Dnmt3a下调，并使小鼠免于产生焦虑样行为，而敲低PBN Dnmt3a似乎足以在初始条件下引起焦虑行为，模拟神经损伤的效应。此外，研究人员表明谷氨酸AMPA受体的GluA1亚基可能是PBN中Dnmt3a在慢性疼痛诱导焦虑中的潜在靶点，因为敲低Dnmt3a会增加PBN中GluA1蛋白水平与GluA1突触功能，改变PBN GluA1水平与焦虑行为程度呈正相关，过表达Dnmt3a压倒慢性疼痛诱导的PBN中GluA1增加并伴随焦虑行为减弱，敲低PBN GluA1阻止慢性疼痛诱导的焦虑行为。这些结果支持慢性疼痛?焦虑共病的一种表观遗传机制，即慢性疼痛下调Dnmt3a，进而上调GluA1表达并增强PBN中AMPA受体的突触功能，通过激活PBN投射导致焦虑行为。