广泛寄生虫传播及与药物耐药性相关的功能性受体变异在流行性曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）中的研究

《SCIENCE ADVANCES》：Extensive parasite transmission and variation in a functional receptor associated with drug resistance in endemic Schistosoma mansoni

　　

使用吡喹酮（praziquantel, PZQ）进行的大规模药物投放（Mass drug administration, MDA）是血吸虫病防控与消除工作的基石。为评估长期MDA如何影响寄生虫种群，研究人员分析了来自8个国家的570份曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）样本及近缘种罗德汉血吸虫（Schistosoma rodhaini）的全基因组测序数据，结合新的寄生虫材料与公开可用的序列数据。研究人员观察到国家间广泛的遗传结构以及广泛的长距离传播证据。对近期确定的瞬时受体电位黑质素离子通道Sm.TRPMPZQ的功能分析揭示了四种与自然发生的吡喹酮敏感性降低相关的变异，表明存在耐药性的常备变异（standing variation）。对治疗前及吡喹酮治疗后从人群中收集的寄生虫微种群（infrapopulations）的分析进一步确定了治疗失败的实例，支持了吡喹酮耐药的可能性。鉴于血吸虫病已被列为到2030年在选定区域通过中断传播作为公共卫生问题消除的目标，本研究为地方性流行种群提供了全面的基因组框架，强调了检测潜在耐药性的方法，并认可了发展精准监测与适应性治疗策略的必要性。

研究背景方面，血吸虫病是一种主要的被忽视热带病，目前感染超过78个流行国的2.5亿人，其中90%发生在撒哈拉以南非洲，主要由曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）、日本血吸虫（Schistosoma japonicum）和埃及血吸虫（Schistosoma haematobium）引起。世界卫生组织（WHO）自2002年起推荐吡喹酮（praziquantel, PZQ）单药疗法作为MDA的核心策略，目标是在2030年前将重度感染比例降至1%以下并中断特定区域传播。然而，尽管MDA取得了一定成效，部分区域患病率在短时间内可逆，且持续存在感染热点。由于缺乏疫苗或替代驱虫药物，寄生虫对PZQ的潜在变异响应构成重大威胁。此前奥沙尼奎（oxamniquine）因耐药性在非洲失效，实验室已能快速筛选出PZQ耐药株，但自然流行种群中确立的PZQ耐药性证据有限。直至近期确定PZQ的分子靶点为瞬时受体电位（Transient Receptor Potential, TRP）黑质素离子通道Sm.TRPM_PZQ，才使得监测自然种群耐药性成为可能。本研究发表于《SCIENCE ADVANCES》，旨在通过全基因组测序表征全球分散的S. mansoni种群，量化候选耐药位点Sm.TRPM_PZQ内的变异以明确潜在耐药突变的流行率，并评估治疗前后的即时遗传影响。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：整合来自8个国家（包括乌干达、坦桑尼亚、肯尼亚、喀麦隆、塞内加尔、波多黎各、瓜德罗普及布隆迪）的574份血吸虫样本（570份S. mansoni及4份S. rodhaini），涵盖新测序的207份样本与公开数据，样本阶段包括毛蚴（miracidia）、尾蚴（cercariae）及实验室传代成虫；对所有样本进行全基因组测序（Whole-genome sequencing）并比对至S. mansoni参考基因组（SM_V9）进行变异调用与质量控制；利用最大似然系统发生树（Maximum-likelihood phylogenetic tree）、主成分分析（Principal components analysis, PCA）及ADMIXTURE进行群体结构分析；计算固定指数（Fixation index, F_ST）与核苷酸多样性（Nucleotide diversity, π）及有效种群大小（Effective population size, N_e）；针对Sm.TRPM_PZQ（Smp_246790）进行单倍型多样性分析（integrated haplotype score, iHS）及靶向诱变结合体外Ca²⁺报告基因检测PZQ敏感性（半数有效浓度EC₅₀）；利用NgsRelate与Sequoia分析宿主内寄生虫微种群（Infrapopulations）的亲缘关系（Kinship coefficients）；使用SMC++推断种群历史动态及LUMPY/SVTyper进行结构变异（Structural variants）基因分型。

研究结果部分保留原文小标题并简述如下：

The genetic diversity of geographically dispersed isolates supports high transmission in endemic regions。研究人员通过分析574份 accession 的基因组数据，构建了最大似然系统发生树与PCA，区分了东非与西非及加勒比海地区的S. mansoni 种群，东非内部（维多利亚湖、艾伯特湖、乌干达东部）形成独特但部分重叠的集群，两两F_ST差异有限（2.49 × 10^?2 至 4.59 × 10^?2），维多利亚湖内部种群分化可忽略（2.41 × 10^?3 至 4.07 × 10^?3）。东非种群具有可比拟的核苷酸多样性（中位π = 2.35 × 10^?3 至 3.35 × 10^?3）与N_e估计值（58,004 至 64,063），提示共享近期种群历史。祖先分析显示大部分无关S. mansoni中存在低水平S. rodhaini混合（0.00 至 2.32%），乌干达东部样本显示多区域混合祖先，暗示迁移。结论为地理分散分离株的高遗传多样性支持了流行区的高传播率。

Functionally relevant genomic variation influences praziquantel sensitivity。研究人员对Sm.TRPM_PZQ进行功能分析，虽iHS未提示该基因在维多利亚湖种群受正选择，但该基因内变异度高（437/2268残基有501种氨基酸变化）。通过靶向诱变12个残基并进行Ca²⁺报告检测，发现8个保守替换突变体EC₅₀与野生型（0.74 μM）相似；p.T1624K与p.R1843Q导致敏感性下降（EC₅₀分别为1.41 μM与1.11 μM）；p.Y1554C与p.Q1670K导致完全丧失敏感性。结构模型显示这些变异位于跨膜区或TRP螺旋等关键功能区。在自然种群中，p.R1843Q（pos.2760344G>A）较常见（26%治疗后前群体），p.I1020l（同义突变）在治疗后群体中频率显著升高。此外发现高频纯合移码突变p.Q1915fs（94.0%）。结论为功能相关的基因组变异影响吡喹酮敏感性，鉴定出4种降低或消除通道响应的自然变异，代表耐药性常备变异。

Host infrapopulations reveal the extent of genetic relationships and evidence of treatment failure。研究人员对3名捐赠者治疗前后164份毛蚴及Koome岛174份样本进行亲缘分析，识别出49个一亲等、13个二亲等及34个三亲等关系，其中47个一亲等在同一宿主体内。Bb1、Bu1、Bu3体内分别识别出入治疗前后亲缘集群及跨治疗臂的一/二亲等关系，提示双亲或单亲存活（治疗失败可能）。Damba岛发现9份三亲等相关accession聚成一支，系统发生上与艾伯特湖样本聚类，提示近期从艾伯特湖传入的谱系扩散。治疗后种群核苷酸多样性未降低，与治疗前F_ST极低（1.24 × 10^?3 至 1.75 × 10^?3）。结论为宿主内微种群揭示了遗传关系程度及治疗失败证据，支持部分寄生虫在治疗后存活。

讨论部分总结：研究人员指出随着消除血吸虫病努力加剧，PZQ单药MDA增加的选择压力可能改变传播动态。Sm.TRPM_PZQ作为PZQ直接靶点近期才被确认，本研究在该基因内识别广泛低频变异并通过功能实验确认4种降低通道敏感性的突变（仅p.R1843Q在多份accession中存在），代表流行种群中PZQ耐药的常备变异。p.R1843Q与实验室耐药标记p.I1020l在治疗后种群更普遍，但可能源于再感染或抽样偏差而非选择。尽管不对称抽样，这些变异在维多利亚湖广泛存在。宿主内微种群极具多样性，识别出治疗后亲缘关系及亲代存活证据，暗示治疗无效或更高耐受性，但受限于样本量未能正式分析遗传基础。总体而言，未发现高频耐药突变令人鼓舞，可能因MDA覆盖不均存在“避难所”（refugia）减缓选择压力，或耐药与表达调控/剪接有关。本研究从跨焦点到个体微种群尺度表征了S. mansoni，识别出新型耐药突变，虽未高频出现但证明常备变异存在，类似oxamniquine耐药前状态，需监测表型与基因型以确保PZQ有效性，并为该靶点功能分析提供资源与基因组多样性基准以指导未来策略。

研究结论部分原文翻译：综上所述，研究人员在多个空间尺度上表征了流行性S. mansoni种群，从主要感染焦点的比较到个体寄生虫微种群。研究人员在候选吡喹酮耐药位点内的变异分析使研究人员能够识别出多种新型赋予耐药性的突变。尽管候选耐药位点在研究种群中尚未上升至高频，但它们确实证明了正在接受MDA的流行性种群中存在吡喹酮耐药的常备变异，这可能类似于oxamniquine在耐药性出现并使其不再作为抗S. mansoni药物有用之前所观察到的常备变异。因此，如果吡喹酮要保持对S. mansoni以及所有人类和牲畜Schistosoma物种控制的有效性，则需要考虑监测吡喹酮耐药的表型和基因型证据。研究人员的分析还为近期确定的该位点的功能分析回顾性或确认性支持提供了资源。最后，研究人员对宿主微种群的广泛测序提供了寄生虫多样性及其对吡喹酮治疗影响的深入基因组表征。总体而言，本研究总结了S. mansoni的基因组多样性，并作为评估当前干预措施效能和指导未来治疗策略的资源。

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