间充质干细胞接收适应性胰岛来源的含miR-151-的小细胞外囊泡以促进肥胖中的β细胞代偿

《SCIENCE ADVANCES》：Mesenchymal stem cells receive adaptive islet–derived miR-151–containing sEVs to promote β cell compensation in obesity

　　

胰腺胰岛通过增加β细胞质量和胰岛素分泌来响应肥胖相关的胰岛素抵抗。然而，这种重要代偿背后的分子机制尚未完全阐明。本研究表明，适应性胰岛来源的小细胞外囊泡（aid-sEVs）在肥胖中β细胞适应过程中发挥关键作用。在高脂血症条件下，aid-sEVs的产生增加，并通过F11R介导的识别被邻近细胞摄取。间充质干细胞（MSCs）在摄取aid-sEVs后作为下游效应细胞，促进β细胞适应性反应。这些囊泡将miR-151递送至MSCs，触发miR-151依赖的细胞重编程，使其向Wnt分泌表型转变。在微小RNA缺陷的aid-sEVs中恢复miR-151可恢复其对β细胞的促适应效应。Klf9作为miR-151的直接靶标，通过调控Wnt3a和Ccnd1的转录参与调节MSCs增殖和WNT分泌。这些发现揭示了饮食诱导肥胖中控制β细胞代偿的关键通路，并表明靶向增强aid-sEVs分泌可能成为抵消糖尿病患者β细胞功能障碍的治疗策略。

**论文解读：适应性胰岛来源小细胞外囊泡通过miR-151调控间充质干细胞促进肥胖中β细胞代偿的机制研究**

**研究背景与问题**
2型糖尿病（T2D）是一种复杂的代谢性疾病，肥胖是其关键风险因素，常伴随胰岛素抵抗、血脂异常及葡萄糖稳态进行性受损。在代谢需求增加时，胰腺β细胞通过适应性改变（如增加β细胞质量和上调胰岛素合成与分泌）维持正常血糖，这一过程称为β细胞代偿。若代偿失败，则胰岛素分泌不足，导致T2D发生。然而，β细胞代偿的分子机制尚未完全阐明。小细胞外囊泡（sEVs）是直径30-150 nm的脂双层囊泡，通过携带微小RNA（miRNA）等生物活性分子介导细胞间通讯，但肥胖条件下胰岛来源sEVs的分子组成、靶细胞及功能意义尚不明确。间充质干细胞（MSCs）存在于几乎所有组织，参与组织再生和稳态，但MSCs是否通过与胰岛通讯调控肥胖中β细胞代偿有待研究。本研究旨在揭示胰岛β细胞与MSCs间的sEVs介导的通讯机制。

**研究人员开展的研究与结论**
研究人员发现，在肥胖进展中，胰岛来源sEVs分泌增加，且胰岛内MSCs数量增多。β细胞通过F11R介导将含miR-151的sEVs递送至MSCs，MSCs随后释放Wnts至β细胞，促进β细胞增殖与胰岛素分泌。适应性胰岛来源sEVs（aid-sEVs）是β细胞启动代偿的“自救”信号。靶向增强aid-sEVs分泌可能成为治疗T2D的策略。该研究发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**主要关键技术方法**
1. 高脂饮食（HFD）诱导小鼠β细胞代偿模型（C57BL/6J小鼠，持续HFD喂养9周）。
2. sEVs分离与表征：超速离心法分离，纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、Western blot鉴定标志蛋白（ALIX、TSG101、CD63、CD81）。
3. β细胞特异性sEVs体内示踪系统：构建Ins2-CD63-EGFP-AAV载体，经胰管注射标记β细胞来源sEVs。
4. 高通量测序：对nid-sEVs和aid-sEVs进行miRNA测序（Illumina NovaSeq 6000），筛选差异表达miRNA。
5. 基因敲除/敲降：CRISPR/Cas9技术构建Dicer、F11R、STXBP1、VAMP2敲除MIN6细胞系；慢病毒载体构建Klf9、E2f6、Mnt3过表达或敲低MSCs。
6. 细胞共培养：Transwell系统（1.0 μm孔径）将MSCs、MS1细胞、RAW264.7细胞与sEVs共孵育后，与MIN6细胞或原代胰岛共培养。
7. 双荧光素酶报告基因实验：验证miR-151与Klf9 3′UTR结合，以及KLF9与Ccnd1、Wnt3a启动子结合。
8. RNA免疫沉淀（RIP）：抗Ago2抗体富集RNA诱导沉默复合体，检测Klf9 mRNA富集。
9. 人血清样本（n=54）来自东南大学附属中大医院，用于检测sEVs水平与血脂相关性。

**研究结果**

**1. 适应性胰岛β细胞中sEVs分泌增加**
通过HFD喂养9周的小鼠（代表β细胞代偿期）分离胰岛，与正常饮食（NCD）小鼠比较。NTA显示适应性胰岛分泌sEVs浓度显著高于正常胰岛，且sEVs大小（50-150 nm）和形态无差异。Western blot检测到sEVs标志蛋白（ALIX、TSG101、CD63、CD81），阴性标志物Grp94未检出。β细胞特异性胰岛素和miR-375在sEVs中检出。Triton X-100和蛋白酶K消化证实胰岛素封装于sEVs内部。sEVs生物发生调节因子RAB11A在适应性胰岛中表达升高。体内实验中，Ins2-CD63-EGFP-AAV注射后，HFD小鼠血清中EGFP⁺ sEVs水平高于NCD小鼠。高胆固醇血症和高甘油三酯血症患者血清sEVs水平升高，且与血脂水平正相关。

**2. Aid-sEVs促进胰岛β细胞代偿**
将aid-sEVs或nid-sEVs静脉注射至HFD喂养6周的小鼠（每周2次，共4周）。与nid-sEVs组相比，aid-sEVs组小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性改善，Ki67⁺ β细胞比例和β细胞质量增加，TUNEL⁺ β细胞无变化。体外实验：aid-sEVs处理原代胰岛后，高糖刺激下胰岛素分泌增加，β细胞增殖增强，但对MIN6细胞无直接作用；而nid-sEVs无此效应，提示sEVs以旁分泌而非自分泌方式作用。

**3. Aid-sEVs被受体细胞摄取部分依赖F11R**
Ins2-CD63-EGFP-AAV注射后，从胰岛分离的MSCs（CD73⁺CD90⁺）、巨噬细胞（F4/80⁺）和内皮细胞（CD31⁺）中均检测到EGFP。DiR标记的aid-sEVs静脉注射后，肝、肺、脾中荧光信号强，且这些器官中的MSCs、巨噬细胞、内皮细胞均摄取sEVs。体外PKH26标记实验证实aid-sEVs被上述细胞内吞。细胞松弛素D抑制MSCs中sEVs摄取效果微弱，但蛋白酶K处理MSCs表面蛋白后显著减少sEVs摄取，提示MSCs摄取依赖蛋白-蛋白相互作用。质谱分析鉴定aid-sEVs膜蛋白，筛选出F11R、STXBP1、VAMP2。构建F11R-KD、STXBP1-KD、VAMP2-KD MIN6细胞并分离sEVs，仅F11R-KD-sEVs被MSCs摄取减少。F11R与PKH26标记的sEVs在MSCs中共定位。F11R-KD MSCs对sEVs摄取显著降低。

**4. 接收aid-sEVs的MSCs是促进β细胞代偿的效应细胞**
将MSCs、MS1细胞、RAW264.7细胞分别与aid-sEVs预孵育（MSC-sEVs、MS1-sEVs、RAW264.7-sEVs），然后与MIN6细胞或原代胰岛共培养。仅MSC-sEVs促进β细胞增殖和GSIS，MS1-sEVs和RAW264.7-sEVs无效。体内实验：HFD喂养8周小鼠注射MSC-sEVs后，血糖降低、血清胰岛素升高、Ki67⁺ β细胞增加、HOMA-IR降低、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性改善、GSIS增强，而MS1-sEVs和RAW264.7-sEVs组无显著变化。Aid-sEVs促进MSCs增殖和蛋白分泌，质谱分析显示Wnt通路相关蛋白分泌增加，qRT-PCR和ELISA证实Wnt3、Wnt3a转录和分泌升高。GW4869抑制sEVs分泌后，MSCs中miR-151水平不再升高，且MIN6增殖减少。

**5. miR-151介导aid-sEVs对β细胞适应的效应**
构建Dicer-KD MIN6细胞，其sEVs（DicerKD-sEVs）缺乏多数miRNA。DicerKD-sEVs处理原代胰岛后，GSIS和β细胞增殖无增强，而aid-sEVs有效。体内实验：DicerKD-sEVs注射小鼠无β细胞增殖、胰岛素敏感性及葡萄糖耐量改善。miRNA测序比较nid-sEVs和aid-sEVs，发现61个miRNA上调，15个下调。Top5上调miRNA中，miR-151丰度最高，且qRT-PCR验证其在aid-sEVs中表达最高。HFD小鼠胰岛中miR-151水平升高，棕榈酸（PA）处理MIN6细胞可重复此现象。miR-151 mimic转染MSCs促进增殖和WNT分泌，miR-151 inhibitor抑制此效应。HFD小鼠胰岛MSCs中miR-151升高，但前体pre-miR-151不变；GW4869处理胰岛后与MSCs共培养，MSCs中miR-151不再升高，提示miR-151外源性来源。在DicerKD-MIN6细胞中过表达miR-151（sEVs^{miR-151 mimic}）或装载miR-151 inhibitor（sEVs^{miR-151 inhibitor}）后，sEVs^{miR-151 mimic}促进原代胰岛β细胞增殖和GSIS，而sEVs^{miR-151 inhibitor}无效；对MIN6细胞无直接作用。体内实验：sEVs^{miR-151 mimic}注射HFD小鼠后，葡萄糖耐量和胰岛素敏感性改善，Ki67⁺ β细胞增加，血清WNT3/3A升高。利用尺寸排阻色谱（SEC）纯化sEVs，排除可溶性污染物，证实纯化aid-sEVs（F4-F8）而非可溶性组分（F9-F20）促进MSCs分泌WNT3/3A和β细胞增殖。

**6. miR-151通过靶向Krüppel样因子9（KLF9）激活MSCs**
生物信息学预测（miRWalk、JASPAR）识别62个候选靶基因，进一步筛选出Klf9、E2f6、Mnt3。过表达Klf9（oe-Klf9）显著抑制MSCs增殖和WNT分泌，而E2f6和Mnt3无显著影响。HFD小鼠胰岛中Klf9表达降低，aid-sEVs处理受体小鼠胰岛中Klf9也降低。miR-151 mimic降低MSCs中Klf9 mRNA和蛋白水平。双荧光素酶报告基因实验证实miR-151直接结合Klf9 3′UTR（野生型降低荧光素酶活性，突变型无变化）。Ago2 RNA免疫沉淀显示Klf9 mRNA富集于RISC复合体。siRNA敲低Klf9（si-Klf9）促进MSCs增殖和WNT分泌，其条件培养基促进原代胰岛β细胞增殖和GSIS。si-Klf9与aid-sEVs联合处理无叠加效应。KLF9可直接结合Ccnd1和Wnt3a启动子区域（双荧光素酶验证），过表达Klf9降低Ccnd1和Wnt3a表达。

**结论与讨论**
本研究鉴定了适应性胰岛来源sEVs（aid-sEVs）在肥胖中β细胞代偿的关键作用。Aid-sEVs通过F11R介导被MSCs摄取，递送miR-151靶向抑制KLF9，促进MSCs增殖和Wnt（Wnt3/3a）分泌，进而增强β细胞增殖和胰岛素分泌（图10）。该通路揭示了β细胞-间充质干细胞间的“自救”信号，为开发增强内源性β细胞代偿的T2D治疗策略提供了新靶点。论文发表期刊：SCIENCE ADVANCES。