月季中RhMPK3-RhLOB41-RhWRKY9模块通过双重控制ROS稳态协调乙烯诱导的花瓣脱落

《SCIENCE ADVANCES》：The RhMPK3-RhLOB41-RhWRKY9 module orchestrates ethylene-induced petal abscission via dual control of ROS homeostasis in rose

　　

器官脱落代表植物生存的关键适应策略，但确保其不可逆性的翻译后机制仍知之甚少。在此，研究人员揭示了一个信号模块，即促分裂原活化蛋白激酶3（MITOGEN-ACTIVATED PROTEIN KINASE 3, RhMPK3）-侧生器官边界域41（LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN 41, RhLOB41）-WRKY DNA结合蛋白9（WRKY DNA-BINDING PROTEIN 9, RhWRKY9），该模块通过协调活性氧（reactive oxygen species, ROS）稳态来控制月季（Rosa hybrida）中乙烯诱导的花瓣脱落。研究人员证明转录因子RhWRKY9作为双功能调节因子，通过激活呼吸爆发氧化酶同源蛋白D（RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOGUE D, RhRBOHD）同时促进ROS产生，并通过抑制过氧化氢酶2（CATALASE 2, RhCAT2）来抑制ROS清除，从而产生锁定脱落进程的ROS爆发。乙烯通过RhMPK3介导的Ser30磷酸化使RhWRKY9的转录抑制因子RhLOB41不稳定，从而启动这一过程。磷酸化产生了一个磷降解子， targeting RhLOB41进行自噬依赖性降解。研究结果将ROS重新定义为脱落的决定性执行者，并将双向ROS控制确立为不可逆发育转变的范式。

器官脱落是植物剔除无用器官的一种不可逆且精细调控的发育过程，对于植物生存和适应环境至关重要。月季是世界上最具经济重要性的观赏植物之一，其切花过早发生花瓣脱落会导致观赏品质和经济价值的大幅下降。在花朵开放和成熟过程中，乙烯的产生量显著升高，而月季花朵对乙烯极为敏感，乙烯会加速花瓣脱落。尽管已有研究表明活性氧（ROS）作为次级信使和加速器在器官脱落中发挥重要作用，且乙烯也可通过转录因子单向调节ROS的产生或清除，但激素与氧化还原信号如何整合，特别是乙烯通过何种翻译后机制精确控制ROS水平以主导花瓣脱落，目前仍不明确。为解决这一问题，研究人员开展了深入探讨，旨在揭示乙烯诱导月季花瓣脱落的翻译后分子机制。该研究成功鉴定出一个由RhMPK3-RhLOB41-RhWRKY9组成的核心信号模块，并阐明了其通过双向调控ROS稳态来控制花瓣脱落的分子机制。这一发现将ROS重新定义为脱落过程的决定性执行者，并确立了双向ROS控制作为不可逆发育转变的范式，具有重要科学意义。该论文发表在《SCIENCE ADVANCES》上。

在关键技术方法方面，研究人员主要采用了以下几种方法开展研究。样本队列来源于北京昌平温室中采集的月季（Rosa hybrida cv. Samantha）花朵及组织培养苗。研究人员利用病毒诱导基因沉默（VIGS）和农杆菌介导的RNA干扰（RNAi）技术进行基因功能缺失分析；借助烟草瞬时表达系统和双荧光素酶报告基因（DLR）系统验证转录因子对靶基因的转录激活或抑制作用；使用酵母双杂交（Y1H）和凝胶阻滞实验（EMSA）验证蛋白质与DNA的体外结合能力；通过分裂荧光素酶互补（SFLC）和免疫共沉淀分析蛋白互作；并运用体外激酶实验和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定磷酸化修饰位点。

研究结果部分总结如下：

ROS介导乙烯诱导的花瓣脱落：研究人员通过使用外源乙烯或乙烯感知抑制剂1-甲基环丙烯（1-MCP）处理月季花朵，并利用氧化敏感的荧光染料DCFH-DA监测离区（AZs）的ROS积累情况。结果表明，乙烯处理显著提高了花瓣离区的ROS水平并加速了脱落，而1-MCP处理则降低了ROS水平并延缓脱落。此外，外源施加ROS生成剂甲基紫精（MV）加速了脱落，而H₂O₂抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）则显著延缓脱落并抑制了乙烯的诱导效应。由此得出结论，ROS是介导乙烯诱导月季花瓣脱落的关键因素。

RhWRKY9通过增强ROS积累加速花瓣脱落：研究人员通过对离区差异表达基因的分析筛选出高表达的WRKY转录因子家族成员，发现RhWRKY9在离区特异性富集且受乙烯显著上调。利用VIGS和RNAi技术沉默RhWRKY9后发现，转基因植株花瓣脱落进程显著延长，且离区的ROS积累水平显著低于野生型。结论表明，RhWRKY9通过增强ROS积累来促进月季花瓣脱落。

RhWRKY9通过调控RhCAT2和RhRBOHD的表达调节ROS积累：为探究RhWRKY9调控ROS的机制，研究人员检测了ROS相关基因的表达。结果显示，在RhWRKY9沉默植株中，ROS清除基因过氧化氢酶2（RhCAT2）表达显著增加，而ROS产生基因呼吸爆发氧化酶同源蛋白D（RhRBOHD）水平下降。Y1H、EMSA和DLR实验证实，RhWRKY9直接结合RhCAT2和RhRBOHD的启动子，抑制RhCAT2转录的同时激活RhRBOHD转录。结论指出，RhWRKY9作为双功能转录因子，通过抑制ROS清除和促进ROS产生双重机制调节ROS稳态。

RhWRKY9在花瓣脱落过程中受RhLOB41直接调控：研究人员通过Y1H筛库寻找RhWRKY9的上游调控因子，发现侧生器官边界域41（RhLOB41）能够结合RhWRKY9启动子并显著抑制其转录活性。沉默RhLOB41后，植株表现出花瓣脱落加速的现象，且离区ROS积累显著增加，同时RhWRKY9和RhRBOHD表达上升而RhCAT2表达下降。结论表明，RhLOB41作为转录抑制因子，通过抑制RhWRKY9的表达来负调控花瓣脱落。

乙烯通过自噬途径促进RhLOB41降解：研究检测发现乙烯处理虽上调了RhLOB41的转录水平，但其蛋白质丰度在乙烯处理后急剧下降。通过使用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂E64d处理，发现E64d能显著抑制乙烯诱导的RhLOB41降解，而MG132则无此效果。结论表明，乙烯不依赖于蛋白酶体途径，而是通过自噬途径促进RhLOB41蛋白的降解。

RhMPK3与RhLOB41互作并使其磷酸化：乙烯处理引起的RhLOB41蛋白电泳条带迁移能被碱性磷酸酶（CIAP）消除。利用丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）特异性抑制剂PD98059预处理发现该条带偏移被完全抑制，证实乙烯诱导的RhLOB41磷酸化依赖于MAPK活性。筛选验证发现RhMPK3与RhLOB41存在体内体外互作且能直接使其磷酸化。沉默RhMPK3导致花瓣脱落延迟及ROS积累减少。结论指出，RhMPK3是与RhLOB41互作并执行磷酸化修饰的关键激酶。

乙烯利用RhMPK3促进RhLOB41降解：通过共表达组成型激活的RhMPK3突变体发现其能显著降低RhLOB41蛋白丰度。通过LC-MS/MS鉴定出磷酸化位点为S30和T110，并获得模拟磷酸化突变体RhLOB41S30D。实验表明磷酸化S30位点会导致RhLOB41不稳定。同时，内源蛋白检测表明随着脱落进程推进，RhMPK3丰度增加而RhLOB41丰度下降。在RhMPK3沉默植株中，乙烯诱导的RhLOB41降解显著受损。结合表型分析证实，RhWRKY9、RhMPK3和RhLOB41是乙烯诱导花瓣脱落途径中的关键组分。结论表明乙烯通过RhMPK3介导的S30位点磷酸化促使RhLOB41发生自噬降解。

在讨论与结论部分，研究人员指出，脱落是一个由复杂发育信号协调的有序生物学过程。本研究鉴定了RhMPK3-RhLOB41-RhWRKY9三重模块作为核心调节枢纽，通过协调ROS稳态控制乙烯诱导的花瓣脱落。RhWRKY9作为双功能转录变阻器，同时激活ROS产生（通过RhRBOHD）和抑制ROS清除（通过RhCAT2），在离区建立ROS爆发，这种双重功能确保了花瓣脱落一旦启动便不可逆地推进。MAPK信号级联通过依赖磷酸化编码的蛋白质稳态重塑转录网络。RhMPK3在S30位点磷酸化RhLOB41，触发其自噬降解，这种机制解除了对RhWRKY9的抑制，确保 ROS 扩增仅在获得发育能力后发生，防止过早脱落。RhMPK3的积累作为脱落信号的调节放大器，将瞬时的激素信号转化为不可逆的发育结果。此外，自噬介导的RhLOB41降解证明了自噬不仅降解胞质成分，还参与细胞核转录因子的选择性清除以重置转录网络。研究人员提出一个三方模型：乙烯激活RhMPK3磷酸化并降解RhLOB41；解除对RhWRKY9的抑制；促使RhWRKY9通过激活RhRBOHD和抑制RhCAT2放大ROS信号。综上所述，本研究不仅阐明了月季花瓣脱落中乙烯-ROS信号模块的主导驱动机制，也为不可逆发育转变的调控提供了新见解。