翻译速率与转录组的同步测量揭示活性细菌细胞群体内的关联性调控

《SCIENCE ADVANCES》：Simultaneous measurements of translation rate and transcriptome uncovers linked regulation within an active bacterial cell population

　　

克隆性细菌种群内部的细胞间变异可为细菌群落提供重要优势，包括风险分散（bet-hedging）机会以及代谢分工。近年来，细菌异质性的范围已在转录组层面以及细胞生长速率和翻译速率等生理学测量层面得到表征。然而，能够将生理参数与单个细胞完整转录组状态相联系的方法仍然缺乏，这使得识别将生理状态与转录输出耦联的调控机制变得困难。研究人员在此提出一种方法，该方法将点击化学（click chemistry）介导的新生多肽标记用于单细胞翻译速率测量，并结合微流控包封与单细胞转录组测量，从而在数千个枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）单细胞中实现翻译速率与转录组的串联测量。在经历营养限制的培养条件下，研究人员鉴定出一个蛋白质翻译速率更高的细胞亚群，该亚群高表达多个代谢过程相关基因，包括乙偶姻（acetoin）生成和精氨酸合成。基于该亚群中的基因表达信息并结合遗传学策略，研究人员鉴定出一种调控机制：转录调节因子AlsR蛋白丰度的升高，与该亚群中受alsR调控基因的表达相耦联。

该论文发表于《SCIENCE ADVANCES》，围绕细菌克隆群体内部生理异质性与转录异质性之间的耦联关系展开。研究背景在于，细菌即使在遗传背景一致的群体中，也普遍存在形态、代谢、生长和基因表达层面的细胞间差异。这种异质性与风险分散、抗逆存活及代谢分工密切相关，因此对理解群体适应性和功能组织具有基础意义。既往研究已经能够利用荧光报告系统或单细胞RNA测序描绘细菌异质性，但前者通量有限，后者虽然能在全基因组尺度描述转录状态，却难以直接反映细胞在一个时间窗口内的真实生理活动。特别是在细菌中，mRNA丰度低、半衰期短且转录具有脉冲性，仅凭转录组快照难以判断细胞的持续功能状态。与此同时，翻译速率作为反映细胞总体活性的核心指标，已被证实在不同细菌及不同生长条件下具有显著异质性，但一直缺少能够在同一单细胞内同时读取翻译速率与完整转录组的方法。基于这一问题，研究人员开发了scTR-seq（single-cell translation and RNA-seq），旨在将单细胞翻译速率与单细胞转录组直接关联，从而识别连接两者的调控机制。

在技术上，研究人员将O-propargyl-puromycin（OPP，一种可掺入新生肽链的翻译标记分子）与点击化学标记体系结合，不再使用传统荧光团作为终端读出，而是以带有叠氮基团和荧光基团的寡核苷酸探针替代，使翻译活性被转化为可被测序捕获的核酸信号。随后，该信号与覆盖枯草芽孢杆菌转录组的探针共同进入既有的ProBac-seq单细胞细菌转录组流程，借助10x Genomics微流控平台完成单细胞包封、条形码标记和文库构建，最终在同一细胞水平同步获得翻译与转录两类信息。研究对象主要为S7最小培养基中生长、处于生长曲线过渡期并面临营养限制的枯草芽孢杆菌单细胞群体。

主要技术方法概括如下：研究人员首先优化了基于OPP的点击化学寡核苷酸标记体系，引入含BTTAA、PEG-8000、CuSO₄和抗坏血酸钠的反应缓冲液，提高寡核苷酸点击偶联效率；随后将标记后的细胞与29,765条转录组探针及一条针对OPP-寡核苷酸的特异探针共同杂交，并采用10x Genomics Chromium微流控系统进行单细胞包封与条形码化；测序后利用Cell Ranger和Seurat进行聚类、差异表达分析及基因集富集分析（GSEA）；同时结合荧光显微镜、启动子报告系统、AlsR-GFP融合蛋白和遗传缺失株，对关键调控因子进行验证。

研究结果部分首先建立并验证了“利用点击化学添加寡核苷酸索引测量翻译速率”的方法。研究人员基于既往用于哺乳动物和细菌细胞总体翻译测量的OPP标记策略，设计了3′端带叠氮基、5′端带Cy3的DNA寡核苷酸oligosynth，使其可通过点击反应连接到含有OPP标记的新生肽链。由于商业试剂盒中的荧光团具有促进铜离子局部富集的特殊结构，而合成寡核苷酸不具备该修饰，研究人员重新设计了含铜反应体系，成功恢复并提高了寡核苷酸标记效率。对照实验显示，在正常生长、链霉素处理和急性饥饿条件下，oligosynth信号依赖于活跃的蛋白质合成。进一步的双标实验表明，寡核苷酸标记信号与传统荧光信号在细胞内斑点定位及单细胞总体信号强度上均高度相关，说明该新方法能够可靠报告翻译速率。

在“scTR-seq：利用微流控包封配对单细胞翻译速率与转录组测序”部分，研究人员将新建立的翻译标记体系整合进ProBac-seq流程，在生长过渡阶段对枯草芽孢杆菌进行分析。经过质控过滤后，共获得14,785个单细胞。基于RNA表达谱的无监督聚类识别出7个细胞簇，其中去除过小簇后保留主要细胞群体。将OPP探针信号叠加到聚类结果后，研究人员发现cluster 4显著富集OPP信号，提示该群体具有更高的翻译活性，并与显微镜下观察到的高荧光细胞相一致。该结果证明，scTR-seq能够在大规模单细胞中稳定实现翻译速率与转录组的同步测量。

在“不同转录组特征及特定遗传调控因子与高翻译速率单细胞相关”部分，差异表达分析揭示cluster 4这一高翻译活性亚群具有独特的转录特征。该群体高表达精氨酸生物合成、溢流代谢（overflow metabolism）和质子驱动力（proton motive force）相关基因。基因集富集分析进一步提示Rex和AlsR可能是调控该群体基因表达的重要遗传调节因子，其中AlsR尤其关键，因为其靶基因alsS和alsD是该簇中最显著上调的基因之一。alsS和alsD编码乙偶姻生物合成所需组分，而乙偶姻是枯草芽孢杆菌在生长过渡期和生物膜状态中的关键溢流代谢产物。研究人员通过P_alsSD-YFP荧光报告系统，在未加OPP的培养条件下也观察到alsSD表达异质性，说明这一转录异质性并非由标记步骤本身造成。研究人员还检测了OPP处理可能引发的转录效应，发现20 min OPP处理确实会上调部分伴侣蛋白基因，但cluster 4中alsSD及其他代谢基因的上调并非由OPP诱导，支持该亚群的生理特征具有内源性。除cluster 4外，其他细胞簇也表现出不同功能程序，如cluster 1富集氨基酸合成、核糖体亚基和运动相关基因，cluster 3则富集氧化应激响应基因。

在“高蛋白质合成细胞簇中转录调节因子AlsR的丰度与AlsR靶基因高表达相关”部分，研究人员进一步剖析了高翻译亚群中alsS/alsD高表达的调控基础。首先，虽然GSEA提示Rex可能参与调控，但通过比较野生型与Δrex菌株中的P_alsS-YFP单细胞表达，研究人员发现无论是否缺失Rex，alsS仍表现出明显细胞间异质性，说明Rex并不是形成该异质性的必要因素。随后，研究人员转向alsSD操纵子激活因子AlsR。由于cluster 4既具有更高OPP信号，又高表达乙偶姻生物合成基因，研究人员提出细胞间翻译速率差异可能影响AlsR蛋白水平，进而驱动其下游靶基因的表达差异。为验证这一点，研究人员构建了原位AlsR-GFP融合株，并确认该融合蛋白保持功能。单细胞成像分析显示，将OPP标记最强的前25%细胞定义为高蛋白质合成（HPS）组后，HPS组的AlsR-GFP荧光显著高于随机抽样组，表明高翻译细胞中AlsR蛋白丰度更高。进一步相关性分析表明，单细胞OPP信号与AlsR-GFP信号呈正相关，R² = 0.5571。与此同时，单细胞RNA测序数据中alsR转录本在cluster 4并未呈现统计学显著升高，说明alsSD表达异质性并非主要源于alsR转录变化，而更可能与AlsR蛋白水平变化有关。研究人员还利用组成型GFP对照验证，高OPP阳性细胞总体上确实存在全局翻译增强，因此AlsR蛋白增加可被视为高翻译状态的一部分，而这一蛋白水平升高又与其靶基因表达耦联。

讨论部分指出，scTR-seq建立了首个能够在细菌单细胞中同时连接转录组与翻译速率的技术框架，使研究者能够把一个细胞的基因表达清单与其在一段时间内累积形成的生理活动速率对应起来。与许多多组学技术仅提供两个静态分子层读出不同，该方法中的全局蛋白质合成信号本质上是一个时间积分速率指标，能够反映用户设定脉冲时间窗口内的细胞活性。研究结果表明，在营养受限的枯草芽孢杆菌群体中，存在一个翻译更活跃的细胞亚群，其特征是上调溢流代谢、氨基酸生物合成和电子传递相关程序。更重要的是，研究人员证明该亚群中AlsR蛋白水平升高，而alsR转录本并未显著升高，从而为“调控因子的蛋白丰度变化连接其下游转录输出”提供了直接证据。这提示在细菌单细胞状态调控中，仅分析转录水平可能遗漏关键机制，而蛋白质合成速率的差异能够在特定亚群中塑造调控网络输出。

论文也指出了方法学限制。其一，OPP即便在短时间和亚抑制浓度下仍可引发一定转录响应；其二，这类标记技术要求标记分子在环境中均匀扩散，因此在生物膜、原位环境或非振荡条件下可能出现标记偏倚。尽管如此，研究人员认为，相较于需要依赖修饰氨基酸摄取的HPG或AHA方法，OPP更适合细菌翻译速率测量，因为其不依赖特殊摄取途径，且所用浓度对细胞生长为亚抑制。总体而言，scTR-seq为解析单细胞内转录与翻译活动的耦联提供了新的研究窗口，也为未来研究抗生素持留、细胞生长律以及其他生理过程与转录组之间的对应关系奠定了方法基础。

研究结论部分可概括为：研究人员建立了scTR-seq技术，通过点击化学介导的寡核苷酸连接，实现了细菌单细胞翻译速率与转录组的同步测量。该方法在枯草芽孢杆菌营养限制培养中鉴定出一个高蛋白质翻译亚群，该亚群高表达乙偶姻生成、精氨酸合成及其他代谢相关基因。进一步研究表明，该亚群中转录调节因子AlsR的蛋白丰度升高，并与其靶基因表达增强相联系，尽管alsR本身转录水平未显著增加。上述结果揭示了细菌单细胞中翻译活性异质性与转录调控网络之间的内在联系。