铁过载抑制LKB1并通过IL36G介导胰腺导管腺癌(PDAC)转移中的抗肿瘤免疫

《SCIENCE ADVANCES》：Iron overload suppresses LKB1 and induces IL36G anti-tumor immunity in PDAC metastasis

　　

胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA）是一种侵袭性癌症，常表现为弥散性疾病。PDA转移微环境施加了独特的代谢应激，可能产生依赖环境的脆弱性。因此，研究人员在PDA肝转移模型中采用基于CRISPR的遗传筛选，以识别新颖且可能可靶向的弱点。值得注意的是，重链铁蛋白（Ferritin heavy chain, FTH1）成为最显著的肝脏特异性依赖因子——FTH1缺失特异性地在肝脏微环境中抑制肿瘤生长。FTH1缺失及随后的铁处理紊乱引发线粒体功能障碍和离子失衡，包括胞质钙过载。这些扰动导致转录程序的激活，触发由免疫刺激细胞因子IL36G介导的抗肿瘤免疫。机制上，FTH1缺失及随后的离子失衡导致肿瘤抑制因子Stk11（LKB1）蛋白水平降低，研究人员提出其由位于LKB1的5′-UTR中的一种RNA G-quadruplex介导。LKB1蛋白水平的丢失改变信号级联反应，导致SIK信号减少和无义介导的衰变（nonsense mediated decay, NMD）抑制，最终导致Il36g mRNA稳定。综上所述，本研究阐明了调节LKB1翻译的新型离子破坏机制，该机制通过先前未描述的5′UTR中的四链体实现，改变了可被靶向以在PDA中产生抗肿瘤免疫反应的信号轴。

该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。胰腺导管腺癌（Pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）预后极差，超过50%的患者确诊时已发生转移，肝脏是最常见的转移部位，目前对其转移定植的代谢适应机制理解尚浅。鉴于体外模型无法模拟体内复杂微环境，研究人员通过开展体内代谢聚焦的CRISPR筛选，旨在揭示PDAC肝转移特异性的代谢依赖，探索铁代谢重编程与免疫调控的关联，为靶向治疗提供新思路。

研究人员主要采用的关键技术方法包括：利用携带Kras突变和p53功能缺失的转基因小鼠模型（KPC）来源的细胞系，进行体内CRISPR-Cas9代谢基因文库筛选（靶向约2900个代谢基因）；建立半脾切除（hemisplenectomy）肝转移模型、皮下成瘤及原位种植模型，并在免疫健全C57BL/6小鼠与免疫缺陷NSG小鼠中进行对照；应用U-¹³C-葡萄糖稳定同位素示踪联合液相色谱质谱（LC-MS）分析代谢流；通过转录组测序（RNA-seq）与实时荧光定量PCR分析基因表达；利用免疫印迹（immunoblotting）检测蛋白修饰与表达；采用电子显微镜观察线粒体超微结构；进行逆转录足迹（RT footprinting）、二甲基亚砜突变谱测序（DMS-MaPseq）、圆二色光谱（CD）及核磁共振（NMR）解析RNA G-quadruplex结构；使用RNA稳定性实验评估无义介导的衰变（NMD）活性。

FTH1 knockout is a liver-specific metabolic liability that acts via both cell autonomous and non-cell autonomous mechanisms

研究人员通过比较肝转移筛选与皮下成瘤及体外培养的CRISPR筛选数据，发现FTH1是肝脏特异性代谢弱点。验证实验显示，Fth1敲除（KO）细胞在2D、3D培养、皮下及原位胰腺种植中生长无差异，但在肝转移及直接肝注射模型中肿瘤负荷显著降低。在免疫缺陷NSG小鼠中，FTH1缺失引起的生长抑制效应减弱（约2倍 vs 免疫健全鼠约8倍），表明FTH1缺失通过细胞自主性与非细胞自主性（免疫介导）双重机制抑制肝脏肿瘤生长，且肺转移模型中无此表型，证实其为肝脏微环境特异性依赖。

Iron overload causes mitochondrial dysfunction and glycolytic rewiring in ferritin deficient cells

肝脏高铁环境下FTH1缺失导致铁过载。研究人员发现高浓度枸橼酸铁铵（FAC）处理下，sgFth1细胞增殖受抑且未被铁死亡抑制剂挽救，排除铁死亡主导。U-¹³C-葡萄糖示踪显示上清糖酵解与磷酸戊糖途径（PPP）重构，出现异常的M+3标记模式，提示碳循环增加以产NADPH抗氧化。三羧酸循环（TCA）代谢物分析及氧消耗率（OCR）测定表明线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）受损，伴随电子传递链复合物II组分SDHB减少、丙酮酸脱氢酶（PDH）去磷酸化受抑。电镜证实线粒体嵴结构破坏，过表达Fth1 cDNA可回救上述表型。

Iron-induced metabolic changes drive altered ionic homeostasis and activation of an immunostimulatory cytokine in Fth1 KO cells

铁过载致糖酵解与线粒体紊乱后，研究人员监测离子稳态发现FTH1 KO细胞在FAC处理后Na⁺/K⁺-ATPase活性受抑及催化亚基ATP1A1减少，依赖NCX反向转运排Na⁺致胞质钙过载（GCaMP6s报告基因证实）。RNA-seq显示免疫刺激因子Il36g在FTH1 KO加铁过载条件下显著上调。共缺失Il36g可恢复肝转移瘤生长并减少CD8a⁺ T细胞浸润；过表达Atp1a1可部分恢复离子平衡并抑制Il36g诱导，证明离子失衡驱动IL36G介导的抗肿瘤免疫。

Iron overload drives IL36G expression through inhibition of LKB1 signaling

研究人员发现FAC处理的FTH1 KO细胞中LKB1蛋白水平下降，其下游SIK磷酸化与IIa类HDAC磷酸化降低，而过表达Lkb1 cDNA或Atp1a1可回救LKB1水平并抑制Il36g。使用SIK抑制剂（SIKi）或高渗NaCl、钙离子载体ionomycin处理均能降低LKB1蛋白并诱导Il36g，且Lkb1 mRNA水平未变，提示翻译水平调控。外源Lkb1 cDNA（无5′UTR）不受FAC影响，指向5′UTR调控。

Identification of RNA G-Quadruplex in LKB1

研究人员通过生物信息学预测Lkb1 5′UTR含RNA G-quadruplex。RT足迹实验在KCl条件下观察到逆转录停滞于5′UTR区域；DMS-MaPseq显示KCl条件下nt 280–339区域反应性降低；CD光谱在~265 nm处正峰增强及NMR在10.56、10.74、11.01 ppm处出现特征共振峰，证实LKB1 5′UTR在K⁺环境下形成G-quadruplex结构，推测胞内离子紊乱（如钙增加）促进该结构形成阻碍翻译。

Iron overload drives Il36g expression through disruption of NMD

研究人员发现铁过载下多个NMD靶基因（如Ddit3）上调，核心组件UPF1磷酸化降低。NMD抑制剂KVS-0001稳定了Il36g与Ddit3 mRNA；FAC处理同样稳定这些转录本。过表达Lkb1 cDNA回救SMG1磷酸化并恢复体内肿瘤生长。抑制SIKi与NMDi在原位模型中协同诱导抗肿瘤反应。人PDAC细胞PaTu-8902中验证了FTH1 KO致LKB1下降、IL36G诱导及人LKB1 5′UTR G-quadruplex保守性。

讨论部分总结指出，研究人员通过体内代谢CRISPR筛选确定FTH1为PDAC肝转移特异性依赖，铁过载引发代谢重编程与离子失衡。LKB1作为代谢主激酶，其蛋白水平受LKB1 5′UTR内RNA G-quadruplex翻译抑制下调，进而通过SIK-HDAC轴转录激活IL36G及抑制NMD稳定Il36g mRNA，诱发抗肿瘤免疫。离子环境可能广泛调控含G-quadruplex的mRNA翻译。靶向SIK与NMD联合策略或在PDAC具治疗潜力。研究结论翻译如下：基于上述分析，研究人员提出工作模型：铁诱导的离子失调导致LKB1 5′UTR中G-quadruplex介导的翻译抑制，扰动SIK与NMD信号通路，共同作用于Il36g转录与稳定及后续抗肿瘤免疫刺激。开发更高效SIK与NMD抑制剂或为激活PDAC抗肿瘤免疫提供新途径。