疾病景观指导的中性粒细胞特异性报告分子设计用于体内和尿液中早期准确检测肺炎

《SCIENCE ADVANCES》：Disease landscape–guided design of neutrophil-specific reporters for early and accurate pneumonia detection in vivo and in urine

　　

摘要
准确且早期检测肺炎对于有效治疗至关重要；然而，当前的诊断方法常常缺乏必要的特异性和敏感性。在此，研究人员首先进行全面的生物信息学分析，确定中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）为与肺炎进展相关的关键生物标志物。随后，研究人员开发了一种NE响应性探针（NERP），由半菁荧光团连接NE敏感肽组成，专门设计用于在炎症组织中激活。为了便于尿液分析，NERP进一步优化为亲水性主动靶向响应性探针（ATRPH）。ATRPH在体内成像和基于尿液的检测中均表现出卓越的敏感性，其中尿液分析提供了一种无创、早期诊断的选择，克服了组织穿透和低准确性的限制。此外，ATRPH在药物筛选、剂量优化以及探索NE产生机制方面也非常有效。这种生物标志物筛选和设计策略不仅通过不同给药途径增强了肺炎的诊断和治疗，而且对其他炎症性肺部疾病也具有更广泛的应用潜力。

论文解读文章

**研究背景与问题**
肺炎是全球最常见的感染性疾病之一，其急性发作和复杂病因尤其威胁儿童和老年人等免疫低下人群。早期准确诊断对降低死亡率、改善临床结局至关重要。当前诊断工具包括胸部X线、计算机断层扫描（CT）、肺部超声和磁共振成像，但存在空间分辨率不足、电离辐射暴露、无法高精度检测早期病变等问题，同时全球放射科医生短缺也延误了诊断。分子成像虽能实现无创可视化生物过程，但现有探针在肺炎诊断中面临特异性差、组织穿透性有限等挑战。中性粒细胞在肺炎进展中起关键作用，其释放的中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是重要标志物。因此，开发能够检测NE相关生物学事件的多模态分子探针对于更准确、及时的肺炎诊断至关重要。

**研究概述与主要结论**
本研究通过综合生物信息学分析确认NE为肺炎进展的关键生物标志物，进而设计并优化了NE响应性探针（NERP）及其亲水性衍生物ATRPH。ATRPH在体内原位成像和尿液检测中均表现出高敏感性，尿液分析可在3小时即检测到肺损伤，早于传统方法（12-24小时），且具无创性。该探针还可用于药物筛选、剂量优化及NE产生机制研究。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**关键技术方法**
研究人员从Gene Expression Omnibus（GEO）数据库获取GSE42830人类肺炎患者血液表达谱和GSE159161小鼠单细胞RNA测序数据，通过Limma、GO、KEGG、PPI等生物信息学分析确定NE为关键靶点。采用荧光半菁染料CyOH与NE敏感肽AAPV偶联合成NERP，并通过铜(I)催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC）连接PEG_2K得到ATRPH。采用LPS诱导的急性肺损伤（ALI）小鼠模型（C57BL/6小鼠）进行体内实验，使用IVIS光谱成像系统进行近红外荧光（NIRF）成像，并结合流式细胞术、ELISA、H&E染色等方法验证。

**研究结果**

**Analysis of signatures in pneumonia**
通过对GSE42830数据集的差异表达基因分析，发现OLFM4、RETN、LTF、CEACAM6、CEACAM8、OLR1、MMP8、ELANE、BPI、ARG1等10个关键枢纽基因与中性粒细胞活化相关。GO和KEGG分析显示这些基因富集于中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成等通路。进一步对LPS诱导小鼠肺的单细胞RNA测序数据分析，发现中性粒细胞在支气管肺泡灌洗液中占77%，且NE（ELANE）在肺损伤中上调14倍，MPO上调24倍，确认NE为肺炎生物标志物。

**Involvement of NE in the pathogenesis of pneumonia**
在LPS诱导的ALI小鼠模型中，CT显示12-24小时出现肺密度增加。NE表达在3小时即升高，流式细胞术显示Ly6G⁺CD11b⁺中性粒细胞和NE⁺细胞在12小时达到峰值。免疫荧光和H&E染色证实肺损伤随时间加重。线性回归表明NE⁺细胞比例与肺损伤评分（R²=0.86）和TNF-α水平（R²=0.92）强相关。

**Synthesis of NERP and in vitro detection**
NERP由CyOH与AAPV-PABA偶联合成，在NE作用下荧光增强10倍，Km为167.1 μM，催化效率1.67×10^-4 μM^-1 s^-1。对多种酶和ROS无响应。在骨髓来源中性粒细胞中，NERP荧光激活与游离CyOH相当，信号强度是非特异性细胞（如BMDM、BMDC、MLE-12等）的3-7倍，且可被抑制剂西维来司他抑制。

**Comprehensive assessment of ATRPH for ALI detection**
ATRPH通过PEG化增强水溶性，经气管内给药后，在ALI 12小时和24小时小鼠的肺部和膀胱中观察到显著NIRF信号，最早在3小时即可检测到膀胱信号增强。尿液分析显示，LPS处理后3小时起尿中NIRF信号即升高（6.5倍），12小时达15.6倍，优于CT、ELISA和H&E染色。在急性肾损伤（AKI）和急性肝损伤（ALIi）模型中，ATRPH尿液信号仅对肺损伤特异性升高，表明其高度特异性。ROC曲线分析显示尿液检测的AUC为0.99，肺内检测为0.87。

**Drug screening and dosage optimization in ALI treatment**
使用乌司他丁、低分子肝素（LMWH）、血必净、地塞米松和西维来司他治疗ALI小鼠，ATRPH肺内NIRF信号分别降低38%、59%、83%、93%和89%，尿液信号分别降低6%、22%、43%、8%和62%。乌司他丁剂量优化实验表明高剂量（20 mg/kg）降低肺NIRF信号3.8倍，与流式细胞术结果一致。

**Exploring mechanisms of NE production in LPS-induced ALI**
使用TLR4抑制剂（雷沙托韦）、PKC抑制剂（鲁布西他林）、ROS抑制剂（乙酰半胱氨酸）和PAD4抑制剂（辛伐他汀）处理ALI小鼠，肺NIRF信号分别降低7.8、6.7、5.8和4.5倍，尿液信号分别降低87%、75%、73%和45%。流式细胞术揭示了TLR4→PKC→ROS/PAD4→CitH3→NE的信号级联。

**Imaging of other pulmonary diseases**
在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）肺炎和流感病毒（PR8）肺炎模型中，ATRPH肺NIRF信号分别升高4.1倍和2.1倍，尿液信号升高6.4倍和2.3倍；而在博来霉素诱导的肺纤维化（BLM）模型中无显著变化，说明ATRPH对急性感染性炎症敏感，对慢性纤维化不敏感。

**Development of ATRPs for real-time imaging of ALI**
为拓展静脉给药途径，研究人员制备了含阳离子脂质的ATRPL（脂质体）和掺入RAW 264.7细胞膜的ATRPM（膜掺杂纳米颗粒）。ATRPL（含71% DDAB）在ALI小鼠肺中显示1.7倍NIRF信号增强，尿液信号升高3.3倍；ATRPM在肺中信号增强1.3倍，但肝脏信号更强，适用于系统性炎症检测。

**讨论与结论**
本研究通过生物信息学驱动识别NE为关键生物标志物，设计并优化了NERP及ATRPs系列探针。ATRPH在体内成像和尿液检测中均表现出高敏感性（整体检测准确率近95%），可在3小时检测到肺损伤，早于传统方法。在药物筛选中，ATRPH可评估不同药物疗效，并与流式细胞术结果一致。在机制研究中，ATRPH揭示了LPS诱导NE产生的信号通路。ATRPL和ATRPM通过静脉给药实现了肺损伤检测。该研究为肺炎早期诊断和精准治疗提供了新工具，并拓展至其他炎症性肺病。但需进一步优化粒径、制剂和临床转化，包括规模化合成、大规模动物模型验证、体液检测标准化等。