单细胞和空间组学揭示转移性高风险神经母细胞瘤的区域特异性可塑性和治疗脆弱性

《SCIENCE ADVANCES》：Single-cell and spatial omics reveals region-specific plasticity and therapeutic vulnerabilities in metastatic high-risk neuroblastoma

　　

神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）是一种源自外周神经系统交感神经节的儿童肿瘤，常发生转移，导致预后不良。原发性神经母细胞瘤已被充分表征，但转移的潜在机制仍不明确。在本研究中，通过使用单细胞和空间多组学（single-cell and spatial multiomics），研究人员发现，与原发性肾上腺肿瘤相比，高风险神经母细胞瘤的淋巴结转移显示出独特的细胞异质性和可塑性（plasticity），其特征为间充质样（mesenchymal-like）和干细胞样（stem-like）状态，以及增强的上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition, EMT）活性。此外，与原发性肾上腺肿块相比，转移性微环境（metastatic niche）显示出增加的免疫抑制性髓系程序（immunosuppressive myeloid programs）、增强的免疫检查点信号（immune checkpoint signaling）和淋巴细胞耗竭（lymphocyte exhaustion），这表明免疫逃逸和功能障碍。值得注意的是，转移性神经母细胞瘤显示出升高的eIF4F翻译机器（eIF4F translation machinery）和XPO1水平。在异种移植模型（xenograft models）中，对eIF4A和XPO1的双重抑制协同阻止了肿瘤生长并延长了生存期。总之，研究人员们的多组学研究揭示了导致治疗耐药性的分子和细胞可塑性，并强调了高风险转移性神经母细胞瘤中可利用的治疗脆弱性。

**研究背景、问题与目的**

神经母细胞瘤（neuroblastoma, NB）是儿童最常见的颅外恶性实体瘤，起源于外周神经系统的交感神经节，具有高度异质性，临床行为从自发消退到快速进展、转移和治疗耐药性不等。尽管强化多模式治疗，但高风险NB（high-risk NB）患者的总体生存率仍仅约50%。超过50%的NB患者在诊断时即已发生转移，常见转移部位包括骨髓、骨骼和远处淋巴结。虽然原发性NB的肿瘤细胞状态，如肾上腺素能样（adrenergic-like, ADRN-like）和间充质样（mesenchymal-like, MES-like）状态已有报道，但淋巴结转移灶中肿瘤细胞动态变化和微环境特征尚不完全清楚。淋巴结可能作为转移的过渡性微环境，是NB细胞适应、与免疫成分相互作用并获得促进播散和耐药性特征的早期场所。因此，阐明淋巴结转移灶的分子和细胞可塑性，对于开发更有效的治疗策略至关重要。

**研究内容与结论**

本研究对高风险NB患者治疗后的原发性肾上腺肿块和淋巴结疾病（包括区域淋巴结受累和远处淋巴结转移）样本，应用了单细胞多组学（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq和单细胞转座酶可及染色质测序，scATAC-seq）和空间转录组学（spatial transcriptomics）技术。这是首次对转移性淋巴结中动态癌细胞状态的单细胞和空间转录组学分析。研究发现，淋巴结转移灶表现出独特的细胞异质性和可塑性，具有显著的间充质样和干细胞样特征，以及增强的上皮-间充质转化（EMT）活性。这些转移性肿瘤细胞还表现出升高的eIF4F翻译机器和核输出蛋白XPO1水平。此外，与原发性肿瘤相比，转移性微环境富含免疫抑制性髓系细胞（尤其是M2样巨噬细胞）、免疫检查点信号（如CD47和CD24）增强，并且淋巴细胞（包括T细胞和自然杀伤细胞）呈现耗竭状态。区域淋巴结疾病表现为从原发性肿瘤到远处转移的中间过渡状态。最后，在动物模型中，通过联合抑制eIF4A和XPO1，协同抑制了肿瘤生长并延长了生存期。

**研究意义**

该研究揭示了高风险NB淋巴结转移灶中独特的分子和细胞可塑性，以及免疫抑制微环境，为理解NB转移机制提供了重要蓝图。研究发现了可靶向的治疗脆弱性，即eIF4F翻译机器和XPO1核输出通路，并提出了联合靶向这两种机制作为治疗高风险NB，特别是MYCN扩增型转移性NB的潜在策略。该研究成果发表在《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）期刊上。

**主要关键技术方法**

研究人员主要采用了以下关键技术方法：1. **单细胞多组学分析**：利用10X Genomics平台对11例患者样本（6例原发性肾上腺肿瘤、5例淋巴结疾病，包括区域性和远处转移，其中2例为配对样本）进行单细胞核RNA测序（snRNA-seq）和单细胞转座酶可及染色质测序（scATAC-seq）。2. **空间转录组学**：使用10X Genomics Visium CytAssist技术对配对的原发肿瘤和远处淋巴结转移组织进行空间转录组分析。3. **生物信息学整合分析**：整合snRNA-seq和scATAC-seq数据，利用SCENIC、ArchR、CellChat等工具分析基因调控网络、染色质可及性和细胞间通讯。4. **体内药效学模型**：使用TH-MYCN转基因小鼠原位同种移植模型和CHLA-15患者来源异种移植（PDX）模型，评估联合靶向eIF4A和XPO1的治疗效果。

**研究结果**

**高风险NB中原发和转移相关淋巴结疾病的不同细胞景观**
通过整合snRNA-seq数据，研究人员发现原发性肿瘤主要由神经母细胞样细胞组成，而淋巴结疾病则包含更多样化的肿瘤细胞状态，包括早期神经母细胞祖细胞和间充质样肿瘤细胞。伪时间分析表明，在淋巴结疾病中，肿瘤细胞获得了更原始、分化程度更低的表型，强调了NB播散过程中谱系可塑性的重要性。

**NB淋巴结疾病中细胞异质性增加**
对肿瘤细胞亚群的无监督聚类显示，淋巴结部位恶性细胞状态的多样性高于原发部位。在淋巴结疾病中，研究人员鉴定出多种新的恶性细胞群，包括：神经嵴神经母细胞（Nbt）祖细胞、间充质神经嵴样肿瘤细胞（MES-Nbt）及其增殖亚群，以及一个独特的DKK2⁺神经母细胞转移表型（DKK2⁺ NB Met）。基因调控网络（SCENIC）分析显示，淋巴结病灶中的肿瘤细胞上调了与早期神经发育、EMT和肿瘤播散相关的调控网络。

**胚胎和EMT程序作为NB细胞在淋巴结位点的核心调控回路**
通过整合snRNA-seq和scATAC-seq数据，研究人员发现，在淋巴结疾病中富集的肿瘤细胞（如Nbt祖细胞和MES-Nbt）中，与神经嵴特化和EMT程序相关的基因（如ZEB1、TWIST1、SNAI1）的染色质可及性及转录因子基序活性增加。差异基因表达和基因集富集分析（GSEA）进一步证实，淋巴结病灶中胚胎干细胞、EMT和间充质特征以及BMP和TGFβ信号通路显著上调。

**淋巴结疾病中存在更高比例的免疫抑制性髓系细胞**
对髓系细胞的分析表明，与原发性肿瘤相比，淋巴结病灶含有更高比例的促肿瘤M2样巨噬细胞，并伴有“别吃我”信号分子（CD47、CD24）及其受体表达的增强，提示淋巴结转移灶通过“别吃我”信号逃避巨噬细胞吞噬。

**NB浸润淋巴结疾病中免疫耗竭程序的上调**
淋巴细胞分析显示，虽然淋巴结疾病中肿瘤相关淋巴细胞比例更高，但活化的CD8⁺ T细胞和自然杀伤（NK）细胞比例降低，且NK细胞表现出更强的耗竭特征（如TOX、TOX2、NFAT5表达升高）。此外，TGFBR1和TGFBR2在多种淋巴细胞表型中表达升高，提示TGFβ信号可能介导了淋巴细胞功能障碍。

**区域淋巴结疾病和远处淋巴结转移表现出不同但相关的转移相关表型**
比较原发性肿瘤、区域淋巴结疾病和远处转移三组，发现区域淋巴结疾病在细胞增殖、间充质活性和肾上腺素能活性方面表现出介于原发肿瘤和远处转移之间的中间转录状态。抗肿瘤巨噬细胞程序从原发性肿瘤到远处转移依次减少，而促肿瘤巨噬细胞程序则依次增加。

**空间转录组学揭示原发性NB和远处淋巴结转移的不同肿瘤微环境**
空间转录组学分析显示，原发性肿瘤中，表达肾上腺素能标志物（如NPY和DBH）的神经母细胞簇占据肿瘤核心，外围被巨噬细胞、成纤维细胞和雪旺细胞包围。而淋巴结转移灶中，肿瘤细胞更靠近T细胞和B细胞，并表现出免疫抑制性TGFβ信号和IGF信号的活跃，提示存在独特的细胞间通讯网络。

**翻译起始和核输出的双重抑制是NB治疗的潜在策略**
研究发现，在转移性NB肿瘤细胞中，eIF4F翻译起始复合物（eIF4A1、eIF4E、eIF4G1）和核输出蛋白XPO1的表达水平显著升高，且其高表达与患者预后不良相关。在体外和体内实验中，联合使用eIF4A抑制剂（rocaglamide）和FDA批准的XPO1抑制剂（selinexor）可以协同抑制NB细胞生长，并在原位同种移植模型和PDX模型中显著抑制肿瘤生长并延长生存期。

**总结讨论与结论**

该研究通过综合单细胞和空间组学分析，揭示了高风险NB淋巴结转移灶中独特的细胞异质性和转录可塑性，这不同于原发肿瘤以肾上腺素能分化为特征的模式。研究结论指出，淋巴结转移灶中的肿瘤细胞呈现出更少分化、更具可塑性的状态，有利于侵袭和耐药，并富含EMT相关基因程序。此外，淋巴结转移灶具有显著的免疫抑制微环境，富含M2样巨噬细胞，并伴有淋巴细胞耗竭和TGFβ信号通路激活。空间转录组学进一步描绘了原发肿瘤和转移灶中不同的细胞空间组织和细胞间通讯网络。研究最终发现，eIF4F翻译机器和XPO1在转移性NB中高表达，且与不良预后相关，联合靶向eIF4A和XPO1在体内外模型中显示出强大的协同抗肿瘤效果。因此，该研究结论总结为：对转移性NB中细胞多样性和信号网络的综合表征，为探索转移部位特异性脆弱性提供了蓝图，并强调了联合靶向eIF4F介导的翻译起始和XPO1介导的核输出在治疗高风险NB（尤其是MYCN扩增型转移性肿瘤）中的潜力。