胡桃（Juglans regia L.）SSR标记亲子关系验证与亲子分配方法比较：基于控制杂交后代的分析

《Forests》：Comparison of Parentage Verification and Parentage Assignment Methods for Walnut (Juglans regia L.) Controlled-Cross Offspring Using SSR Markers

　　

为评估微卫星标记（simple sequence repeat, SSR）用于核桃控制杂交后代真实性检验的有效性，研究人员以中国贵州省改良及广泛栽培核桃品种构建7个控制杂交组合，共获得108个候选后代。60对既往报道的SSR引物中筛选出15个位点，用于扩增稳定性、基因分型清晰度及多态性分析。亲子鉴定分别采用基因型排除法（genotype exclusion）和最大似然法（maximum likelihood），并结合遗传多样性与聚类分析评估方法适用性。15个SSR位点共检测到68个等位基因，平均每个位点4.53个；多态信息含量（polymorphism information content, PIC）为0.017～0.608，均值0.396。基因型排除法确认76个后代与记录的亲本组合一致，总鉴定率为70.37%。最大似然分析在双亲未知时将27个后代分配至最可能亲本对，鉴定率25.00%；已知母本、仅需判定父本时成功分配47个后代，鉴定率43.52%。聚类分析显示，大多数后代与对应亲本聚在较近分支，但部分个体偏离原始组合，提示亲本材料间可能存在等位基因共享或复杂遗传来源。共享母本结构、亲本间近缘背景、高频等位基因及空等位基因（null allele）可能共同影响SSR亲子分配效率。与最大似然法相比，基因型排除法在共享母本、多个近缘父本且SSR多态性中等的核桃育种群体中，对记录杂交组合的验证更稳定。研究表明，在亲本遗传背景相近且标记信息量有限时，基于似然的亲子分配结果需谨慎解释。该研究为核桃控制杂交后代真实性鉴定、谱系管理及分子标记辅助育种提供了技术参考。

本研究围绕核桃（Juglans regia L.）杂交育种中“后代真实性难以核实、亲本来源难以准确追溯”的问题展开。核桃是全球重要的木本坚果树种，在温带地区和中国林业产业中兼具坚果与材用价值。杂交育种是核桃遗传改良的重要途径，但人工授粉误差、花粉污染、标识管理疏漏和材料混杂会削弱田间记录、形态性状和育种经验对后代来源判定的可靠性，因此需要分子标记辅助验证。SSR标记具有共显性遗传、多态性较高、重复性好和检测成本相对可控等优势，已用于果树与木本植物的种质鉴定、遗传关系分析和杂交后代真实性检验。然而，在共享母本、多个父本并存且父本遗传背景较近的实际育种体系中，不同亲子鉴定策略的稳定性仍缺乏系统比较。

基于此，研究人员以贵州省改良及广泛栽培核桃品种构建7个控制杂交组合，比较基因型排除法与最大似然法在亲子关系验证中的表现，并结合遗传多样性与聚类分析评估SSR位点的适用性。研究结果表明，所选15个SSR位点总体具有中等多态性，可用于核桃后代真实性鉴定；其中基因型排除法对记录杂交组合的验证更稳定，而最大似然法受等位基因频率分布、空等位基因及亲本近缘关系影响更大。该研究的重要意义在于明确了在共享母本和近缘父本背景下，SSR亲子分配方法的适用边界，可为核桃谱系管理、材料核查和后续标记辅助育种提供方法学依据。论文发表在《Forests》。

研究方法主要包括：采用CTAB法提取叶片基因组DNA；从60对已报道SSR引物中筛选15个位点；利用毛细管电泳与GeneMapper进行基因分型；分别用基因型排除法和CERVUS 3.0.7中的最大似然法进行亲子鉴定；并通过遗传多样性参数计算、遗传距离分析和聚类分析评估结果。样本来自7个控制杂交组合，共108个候选后代。

### 3.1 SSR位点遗传多样性分析
通过对108个后代和7个亲本材料的15个SSR位点分析，研究人员共检测到68个等位基因，平均每个位点4.53个。PIC值在0.017～0.608之间，均值为0.396，说明各位点多态性存在明显差异。JH91908、JR3773和JR6439表现出较高PIC值和较强鉴别能力，可作为亲子鉴定的辅助标记；而JC5411和JC7329多态性较低，对后代区分贡献有限。JM68820的空等位基因频率较高，提示可能存在扩增偏倚或空等位基因干扰。

### 3.2 基因型排除法亲子鉴定分析
基因型排除法用于核实108个候选后代是否与记录的亲本组合相容。结果显示，76个个体可与对应亲本组合一致，总鉴定率为70.37%。不同组合间鉴定率为53.85%～76.92%，其中XNH × QPH4和XNH × QPH3较高，XNH × LWR最低。JR3434、JH6044、JC8125和JH91908在多个组合中表现出较强排除能力，说明高杂合度和较均衡的等位基因频率更有利于提高验证效率。

### 3.3 最大似然法亲子分配分析
基于CERVUS 3.0.7进行最大似然亲子分配时，15个SSR位点的亲对累积排除概率（CE-PP）达到0.9991，显示标记总体具有较高的亲子识别潜力。但在双亲未知情形下，仅27个后代被分配到最可能的亲本对，鉴定率为25.00%；当母本已知、仅需确定父本时，成功分配47个后代，鉴定率提高至43.52%。等位基因频率分析显示，多个位点存在少数高频等位基因，削弱了近缘材料之间的区分度。共享母本、父本背景相近以及部分位点的空等位基因共同限制了似然法的分配效率。

### 3.4 控制杂交后代与亲本的聚类分析
基于SSR多位点基因型，115份材料被划分为3个主要遗传类群。大多数后代聚集在对应亲本附近，说明所选SSR位点能较好反映不同杂交群体间的遗传关系。XNH × XNH后代形成较紧密类群，显示自交后代内部遗传背景更一致。与此同时，LYH-1、QGR-1、QPH3-1、QPH3-2和QPH4-14未聚入对应杂交分支，提示其遗传来源可能更复杂或存在花粉污染、近缘背景混杂等情况。

### 讨论与结论
讨论部分指出，SSR标记在果树和木本植物亲子鉴定中已较成熟，但其解析力高度依赖群体遗传结构。该研究中，基因型排除法优于最大似然法，原因在于共享母本导致后代间等位基因重叠显著，且多个父本来源于同一地方育种群体、遗传背景较近，降低了似然值区分度。PIC均值0.396表明材料总体为中等多态性；同时，标记信息量不仅取决于等位基因数，还取决于等位基因频率分布是否均衡。JM68820虽多态性较高，但空等位基因频率也高，提示在似然软件中使用时需谨慎。聚类结果进一步表明，核桃育种材料普遍存在近缘背景和广泛等位基因共享，部分后代偏离原始组合说明实际育种中可能存在非预期授粉或复杂遗传来源。

研究结论可概括为：在共享母本、多个近缘父本的核桃控制杂交群体中，15个SSR位点具备一定亲子识别能力，但基因型排除法在真实性验证方面更稳定，最大似然法受群体结构和标记局限影响更明显。因此，在此类育种材料中，应优先采用基因型排除法进行记录杂交组合核实，并谨慎解释基于似然的亲子分配结果。