一种含有MnO2-没食子酸的异种发育基质水凝胶实现激素相关性骨坏死中的时空免疫代谢重编程和软骨内骨修复

《Bioactive Materials》：A xenogeneic developmental matrix hydrogel with MnO2-gallic acid enables spatiotemporal immunometabolic reprogramming and endochondral bone repair in steroid-associated osteonecrosis

　　

激素相关性骨坏死（SON）的特征在于难治性骨缺损微环境，涉及氧化应激、持续性炎症和血管化受损，这限制了常规移植材料的疗效。研究人员开发了一种时序可编程的复合水凝胶GelMA/dECM@MnO₂-GA，通过将人诱导多能干细胞（iPSC）来源的脱细胞外基质（iPSC-dECM）与MnO₂-没食子酸（GA）活性氧（ROS）响应模块整合。植入后，升高的ROS可能诱导MnO₂和GA的释放，这与ROS清除、局部缺氧缓解及炎症信号减弱相关。这种早期氧化还原调节伴随着巨噬细胞极化从M1向M2表型的转变，同时调节性T细胞（Treg）富集增加。研究人员的进一步发现表明，通过CCR4-PI3K/AKT轴介导的CCL22招募Treg可能有助于Treg存活和迁移，强化M2极化，并帮助维持促再生的骨免疫微环境。在后期阶段，保留的iPSC-dECM作为发育基质模板，引导宿主祖细胞经历软骨内骨化样过程，而增强的H型血管形成与血管生成和成骨耦合相关。在大鼠激素诱导的股骨缺损模型中，GelMA/dECM@MnO₂-GA显著促进骨再生并降低局部IL-1β、IL-6和TNF-α的表达。转录组学和功能分析支持GelMA/dECM@MnO₂-GA处理、协调的M2巨噬细胞极化、Treg富集和改善的骨修复之间的关联。总之，这些发现表明，这种时空协调的水凝胶可能为克服激素相关性骨缺损的不良微环境提供一种有前景的策略，并可能与其他难治性骨坏死情况相关。

**研究背景与问题**
激素相关性骨坏死（SON）是长期或大剂量皮质类固醇治疗的常见难治性并发症，是非创伤性骨坏死的主要原因之一，其中股骨头坏死（SONFH）最为常见。传统治疗如核心减压、截骨和骨移植（包括非血管化或血管化游离腓骨移植）虽能改善机械稳定性和局部灌注，但需清除坏死组织、钻孔或开道，其长期疗效依赖于生物受损微环境中的持续骨整合。自体骨移植虽为金标准，但受限于供区并发症，且现有替代物无法复制其再生能力。SON的骨缺损微环境特征包括：活性氧（ROS）过度产生导致氧化应激、促炎性M1巨噬细胞主导的炎症、血管化受损及成骨抑制。ROS通过抑制Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信号抑制间充质祖细胞成骨分化，促进成骨细胞和内皮细胞凋亡，损害内皮屏障功能，并通过激活NF-κB信号加剧炎症和骨丢失。因此，亟需一种能够动态、时序调控局部免疫和代谢微环境的策略，以逆转SON的不良微环境并促进功能性骨修复。

**研究内容与结论**
研究人员开发了一种时序可编程的复合水凝胶GelMA/dECM@MnO₂-GA，将人诱导多能干细胞（iPSC）来源的脱细胞外基质（iPSC-dECM）与MnO₂-没食子酸（GA）活性氧（ROS）响应模块整合于甲基丙烯酰化明胶（GelMA）网络中。在早期阶段，升高的ROS触发MnO₂和GA释放，催化分解H₂O₂为O₂和H₂O，缓解氧化应激和缺氧，并释放Mn²⁺离子，促进成骨细胞功能并抑制破骨细胞活性。同时，GA进一步清除ROS并调节Nrf2/NF-κB信号轴，发挥抗炎和促成骨作用。这些早期事件促进巨噬细胞从M1向M2表型极化，并增加调节性T细胞（Treg）富集，建立促再生的骨免疫微环境。在后期阶段，保留的iPSC-dECM作为发育基质模板，通过提供软骨内骨化（ECO）样程序的生物化学和力学线索，引导宿主祖细胞经历软骨中间体最终形成骨。在大鼠激素诱导的股骨缺损模型中，该水凝胶显著促进骨再生（BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Ct.Th、Ct.Ar/Tt.Ar增加，Tb.Sp减少），并降低局部IL-1β、IL-6和TNF-α表达。转录组学和功能分析表明，水凝胶处理与M2巨噬细胞极化、Treg富集、H型血管形成增强及骨修复改善相关。该研究发表在《Bioactive Materials》。

**主要技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1）人iPSC（Cellapy, CA4025106）经分阶段诱导分化为间充质祖细胞（MPC），并通过流式细胞术（CD44、CD73、CD90、CD105阳性，CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性）鉴定；2）MPC在软骨分化培养基中培养20-30天形成软骨细胞片，经脱细胞处理（水渗透、冻融、Triton X-100/脱氧胆酸钠处理、DNase/RNase消化）生成iPSC-dECM；3）通过KMnO₄与油酸乳化反应制备花状MnO₂纳米颗粒，并负载GA形成MnO₂-GA模块；4）将iPSC-dECM（0.5% w/v）和MnO₂-GA（70 μg/mL）整合入GelMA（10% w/v）中，经冷冻干燥制备复合水凝胶；5）体内实验采用大鼠激素诱导股骨缺损模型（LPS+甲基强的松龙），植入水凝胶后于2和4周进行micro-CT、组织学（H&E、Goldner三色）、免疫组化、免疫荧光及微血管造影分析；6）转录组学分析（RNA-seq）及生物信息学（GO、KEGG、GSEA）；7）体外共培养系统（rBMSCs、HUVECs、BMDMs、PBMCs）结合CCK-8、活死染色、ROS检测、划痕实验、Transwell、管形成、ALP/ARS染色、ELISA、流式细胞术、Western blot及siRNA沉默等。临床样本来自30例SONFH和30例创伤性股骨头坏死（TONFH）患者全髋关节置换术的股骨头标本及血清/滑液。

**研究结果**
**2.1 SONFH以全身性炎症、成骨受损和H型血管形成减少为特征**：通过分析GEO数据集（GSE123568）和临床标本，发现SONFH患者外周血炎症相关基因（IL1B、IL6R、TLR2、TLR4）上调，股骨头标本显示成骨活性降低（Goldner三色染色）、iNOS表达升高、H型血管（CD31^hiEMCN^hi）减少，且血清和滑液中IL-6和IL-1β水平显著高于TONFH组。

**2.2 GelMA/dECM@MnO₂-GA的表征与性能**：SEM显示GelMA具有层状多孔结构，掺入dECM后孔壁粗糙、通道曲折；MnO₂纳米颗粒呈花状约100 nm，具有介孔结构（2-10 nm）；EDS和XPS证实MnO₂和GA成功整合；FTIR和XRD进一步确认；GA释放实验显示约60%在24 h内释放，随后缓释；Mn²⁺释放呈H₂O₂浓度依赖性，证实ROS响应性。

**2.3 GelMA/dECM@MnO₂-GA在氧化应激下赋予细胞保护并增强血管生成功能**：与rBMSCs和HUVECs共培养后，CCK-8和活死染色显示生物相容性；在H₂O₂刺激下，GelMA/dECM@MnO₂-GA组细胞内ROS显著降低，HUVEC迁移（划痕、Transwell）和管形成能力显著增强。

**2.4 GelMA/dECM@MnO₂-GA促进rBMSCs体外软骨内骨化**：ALP和ARS染色显示GelMA/dECM@MnO₂-GA组ALP活性和钙沉积最高；免疫荧光显示OSX和OPN表达最强；qRT-PCR显示肥大相关基因（Col10a1、Ibsp）和成骨基因（Col1a1、Opn、Osx、Runx2）上调，RNA-seq验证了ECO相关通路富集；与胶原对照组相比，dECM组显著促进ECO相关分化。

**2.5 GelMA/dECM@MnO₂-GA促进体内骨再生和血管新生**：在大鼠股骨缺损模型中，micro-CT显示GelMA/dECM@MnO₂-GA组在2和4周时BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Ct.Th、Ct.Ar/Tt.Ar显著增加，Tb.Sp降低；血管造影显示新生血管增加；Goldner三色染色显示更多成熟板层骨；免疫组化显示IL-1β、IL-6、TNF-α表达降低；主要器官H&E染色未见异常。

**2.6 转录组学分析揭示免疫调节和成骨机制**：RNA-seq显示GelMA/dECM@MnO₂-GA组与对照组相比有416个上调基因和361个下调基因；GO富集分析涉及巨噬细胞活化、Treg分化和骨矿化；KEGG通路涉及细胞因子-受体相互作用和PI3K-AKT信号；GSEA显示巨噬细胞活化和促炎细胞因子（IL-1β、IL-6）基因集被抑制，Treg分化基因集富集。体外共培养实验证实，GelMA/dECM@MnO₂-GA促进M2极化（IL-4、IL-10升高，IL-1β、IL-6降低），流式细胞术显示M2比例增加，M1比例减少。

**2.7 GelMA/dECM@MnO₂-GA通过CCL22-CCR4轴促进Treg积累和分化**：水凝胶-巨噬细胞共培养上清液（CM）处理大鼠PBMCs后，ELISA显示Treg极化细胞因子（TGF-β1、IL-2）和CCL22水平升高；流式细胞术显示CD4⁺Foxp3⁺CD25⁺ Treg比例增加；蛋白-蛋白对接预测CCL22-CCR4稳定结合；siRNA沉默CCR4后，Foxp3、Ctla4、Gitr、Il10、Tgfb1表达降低；Western blot显示PI3K/AKT通路激活，FOXP3和IL-10蛋白上调。

**2.8 GelMA/dECM@MnO₂-GA调节早期免疫反应并促进血管生成支持软骨内骨化**：免疫荧光显示，2周时GelMA/dECM@MnO₂-GA组M1（iNOS⁺）减少，M2（Arg1⁺）增加，CD4⁺FOXP3⁺ Treg密度升高；4周时M2优势持续，但Treg水平与对照组无差异；H型血管（CD31⁺EMCN⁺）形成显著增强。

**讨论与结论**
讨论部分指出，GelMA/dECM@MnO₂-GA通过层次多孔结构（GelMA大孔+MnO₂介孔）实现多功能，早期MnO₂-GA清除ROS、缓解缺氧，后期iPSC-dECM提供发育基质线索引导ECO样修复。水凝胶通过CCL22/CCR4/PI3K/AKT轴促进Treg富集，与M2巨噬细胞形成正反馈环，建立促再生免疫微环境，并增强H型血管形成，协调成骨-血管生成耦合。但存在局限性：大鼠模型不能完全模拟人类生物力学复杂性；Treg来源未区分（外周招募或局部扩增）；体内评估时间点仅2/4周，未涵盖长期ECO转换和支架降解；转录组关联机制需进一步验证。结论部分翻译如下：总之，本研究提出了一种基于时序可编程复合水凝胶的再生策略，结合早期氧化还原和炎症调节与发育启发的基质模板。研究人员的发现表明，GelMA/dECM@MnO₂-GA与氧化应激减轻、炎症反应减弱、早期Treg富集、持续M2巨噬细胞主导、H型血管形成增强及改善的ECO样骨修复相关。通过将微环境调节与发育工程原理整合于单一平台，GelMA/dECM@MnO₂-GA可能为改善难治性激素相关性骨缺损的愈合提供一种有前景的方法。