《Biochemical Pharmacology》：Mitochondrial fission-mediated podocyte dysfunction via CaMKII/Drp1 signaling pathways contributes to lenvatinib-induced renal injury
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摘要VEGF信号通路抑制剂会带来诸多不良反应，尤其是以蛋白尿为表现的肾损伤，这些反应会严重影响临床治疗效果及患者的生活质量，其中伦伐替尼引发的肾损伤发生率最高。本研究旨在探究伦伐替尼导致肾损伤的机制，并寻找潜在的治疗策略。我们发现，伦伐替尼会以剂量依赖性方式引发严重的肾小球损伤，
摘要
VEGF信号通路抑制剂会带来诸多不良反应，尤其是以蛋白尿为表现的肾损伤，这些反应会严重影响临床治疗效果及患者的生活质量，其中伦伐替尼引发的肾损伤发生率最高。本研究旨在探究伦伐替尼导致肾损伤的机制，并寻找潜在的治疗策略。我们发现，伦伐替尼会以剂量依赖性方式引发严重的肾小球损伤，表现为蛋白尿、局灶节段性肾小球硬化以及足细胞丢失，而小鼠肾脏中并未出现明显的肾小管损伤。进一步研究显示，伦伐替尼引起的肾小球损伤与足细胞发生类似上皮-间质转化的变化有关，这一变化是由CaMKⅡ介导的Drp1在Ser616位点的磷酸化增加，进而导致线粒体分裂加剧所引发的。我们利用斑马鱼作为体内筛选模型，进一步找到了多种能够抑制线粒体分裂的物质，包括二甲双胍、穿心莲内酯、褪黑素、小檗碱和mdivi-1，这些物质都具有减轻伦伐替尼引起的肾水肿的作用，其中二甲双胍和褪黑素的疗效最为显著。作为一种抗糖尿病药物，二甲双胍还被证明可以通过抑制Drp1(Ser616)的磷酸化，逆转足细胞的类似上皮-间质转化的变化，从而在体外和体内都能减轻伦伐替尼引起的肾毒性。这些研究结果首次表明，足细胞中通过CaMKII/Drp1信号通路加剧的线粒体分裂是伦伐替尼导致肾损伤的重要原因，同时也证明了二甲双胍是一种可用于治疗伦伐替尼引起肾损伤的可行药物。
引言
VEGF信号通路抑制剂已成为癌症抗血管生成治疗中的重要疗法[1]；然而，它们所带来的不良反应，包括肾损伤、高血压、心血管毒性、皮肤毒性以及出血问题，尤其是肾损伤，严重限制了其在临床上的应用[2]、[3]。由VEGF信号通路抑制剂引发的肾损伤以蛋白尿为典型表现，其发生率非常高[4]，且不同靶点对应的临床症状也有所差异。针对VEGFR的小分子激酶抑制剂主要会导致局灶节段性肾小球硬化或微小病变型肾病，而针对VEGF或VEGFR的单克隆抗体则更易引发血栓性微血管病[5]、[6]，不过其背后的作用机制至今仍不清楚。
伦伐替尼能够抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，在未经治疗的晚期肝细胞癌治疗中，其总体生存率与索拉非尼相当[7]。但伦伐替尼引发的蛋白尿发生率在26%到100%之间[4]，其中10%的病例病情较为严重，需要中断治疗甚至永久停止用药[8]。虽然血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素受体阻断剂可通过改善肾脏血流动力学来缓解伦伐替尼引起的肾损伤，但在实验室研究中，这类药物可能会降低伦伐替尼的抗肿瘤效果[9]，还有可能升高血浆肌酐水平，增加因肾病住院的风险[10]、[11]。因此，亟需阐明伦伐替尼引发肾损伤的机制，以便制定有效的预防措施。
肾活检结果显示，伦伐替尼引起的蛋白尿会损害肾小球滤过屏障，其表现包括足细胞足突消失/融合、内皮细胞损伤以及肾小球基底膜增厚[12]、[13]、[14]。肾小球滤过屏障的任何组成部分受损都可能导致蛋白尿出现，但在蛋白尿性肾病的发病过程中，足细胞损伤起着核心作用[15]、[16]。由于足细胞的增殖能力有限，它们在受到损伤后无法有效修复或再生，进而会引发肥大、上皮-间质转化以及细胞凋亡等应激反应，最终破坏肾小球滤过屏障[17]、[18]。上皮-间质转化是一种细胞变化过程，在此过程中足细胞会失去上皮细胞的特征，比如不再表达裂孔隔蛋白（如ZO-1、E-钙粘蛋白、肾足蛋白和足细胞素），反而会出现间质细胞的标志物（如N-钙粘蛋白、波形蛋白和αSMA）[19]、[20]。越来越多的证据表明，上皮-间质转化会在多种肾病中促使足细胞脱落并引发蛋白尿[21]、[22]，因此，了解伦伐替尼诱导的应激状态下足细胞的形态变化，对于理解其肾毒性机制至关重要。
足细胞中含有大量的线粒体[23]、[24]，这些线粒体通过调控线粒体的融合、分裂以及线粒体自噬等过程，维持细胞的稳定性和代谢平衡[25]、[26]。在糖尿病肾病中，过度的线粒体分裂和过少的线粒体融合会导致足细胞受损[27]、[28]。线粒体分裂通常由动力蛋白相关蛋白1（Drp1）调控，这是一种属于动力蛋白家族的蛋白质，它会转移到线粒体外膜上，促使线粒体发生分裂[29]、[30]。值得注意的是，已有研究表明，在急性肾损伤模型中，抑制Drp1可以减轻肾小管上皮细胞的死亡和肾脏损伤，这凸显了线粒体动态变化在肾脏疾病中的关键作用。Drp1在Ser616位点的磷酸化会促使它定位到线粒体外膜，进而引发线粒体分裂[32]。在糖尿病肾病的足细胞中，ROCK1已被确认为调控Drp1在Ser616位点磷酸化的关键因子[33]、[34]，未来还需要进一步研究，以明确Drp1介导的线粒体分裂在伦伐替尼引发蛋白尿中的作用，以及调控Drp1磷酸化的关键因子是什么。
在本研究中，我们发现伦伐替尼会引发过度的线粒体分裂，从而导致足细胞出现类似上皮-间质转化的变化。伦伐替尼处理会通过钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ在足细胞中促进Drp1S616的磷酸化，而抑制Drp1或CaMKⅡ则能改善这种类似上皮-间质转化的变化。令人意外的是，一些抑制线粒体分裂的药物能够在斑马鱼中减轻伦伐替尼引起的肾水肿。此外，我们还发现二甲双胍能够减轻小鼠体内的伦伐替尼引发的肾小球损伤，这说明二甲双胍有望成为治疗伦伐替尼相关蛋白尿的候选药物。
章节节选
材料
胎牛血清、胰蛋白酶以及Dulbecco改良Eagle培养基均购自美国纽约州格兰德岛的GIBCO（Invitrogen Life Technologies）公司。IV型胶原酶则从美国科罗拉多州莱克伍德的Worthington Biochemical Co., Ltd.公司购买，产品编号为LS004188。伦伐替尼（L125518）、Ro3306（R275210）、Y-27632（Y412681）、Go6983（G129385）、二甲双胍（M107827）、Mdivi-1（M824572）、穿心莲内酯（A101649）、褪黑素（M118674）以及小檗碱（B414323）均来自Aladdin Biotechnology公司。
伦伐替尼引发的高发肾损伤及足细胞损伤表现
对VEGF信号通路的抑制治疗通常会伴随肾毒性。因此，我们基于2004年至2024年的FAERS数据库，分析了临床中常用的抗血管生成药物的肾毒性不良反应。如图1A所示，伦伐替尼与2,453例肾损伤病例相关，年均报告病例数为245例，这一数值远远高于其他VEGF信号通路抑制剂对应的年报告病例数（3–195例/年）。此外，ROR
讨论
本研究证实，伦伐替尼引发的蛋白尿是由于足细胞出现类似上皮-间质转化的变化，进而导致肾小球滤过屏障受损。从机制层面来看，伦伐替尼会通过CaMKIIγ促使Drp1在Ser616位点发生磷酸化，进而引发足细胞中过度的线粒体分裂。此外，所有经过测试的线粒体分裂抑制剂都能减轻斑马鱼模型中伦伐替尼引起的肾毒性，其中二甲双胍对减轻伦伐替尼引发的肾毒性的效果最为显著。
资金支持信息
本研究得到了中国浙江省自然科学基金[项目编号LHDMZ24H310002、LQ23H310002]以及中国国家自然科学基金[项目编号82404772]的支持。
CRediT作者贡献说明
陆双辉：论文撰写——初稿撰写、可视化分析、结果验证、概念构思。邱月平：论文撰写——审阅与编辑、概念构思。陈玉佳：结果验证、实验研究。袁乐祥：结果验证、实验研究。陈静：方法学设计。潘立斌：数据整理、概念构思。朱俊峰：项目管理工作。辛文秀：项目管理工作。丁海音：项目管理工作。戴梦菲：方法学设计。江慧迪：论文撰写——审阅与编辑、研究指导。罗芳：
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
陆双辉|邱月平|陈玉佳|袁乐祥|陈静|潘立斌|朱俊峰|辛文秀|丁海音|戴梦菲|江慧迪|罗芳
中国浙江省杭州市浙江科学院杭州医学研究院药学部，中国浙江省杭州市310022
