《Biochemical Pharmacology》：Myeloid UCHL1 deficiency ameliorates sepsis-induced liver injury by suppressing M1 macrophage polarization via targeting Gpi ubiquitination
编辑推荐：
泛素C端水解酶1（UCHL1）是一种关键的去泛素化酶（DUB），它能够从底物蛋白上切割泛素/多聚泛素链，并已被证明能够促进氧化应激和炎症反应。然而，UCHL1在脓毒症诱导的肝损伤（SILI）发病机制中的确切作用仍然未知。在此，研究人员展示了在盲肠结扎穿刺（CL
泛素C端水解酶1（UCHL1）是一种关键的去泛素化酶（DUB），它能够从底物蛋白上切割泛素/多聚泛素链，并已被证明能够促进氧化应激和炎症反应。然而，UCHL1在脓毒症诱导的肝损伤（SILI）发病机制中的确切作用仍然未知。在此，研究人员展示了在盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的肝脏和脂多糖（LPS）处理的骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中UCHL1的表达升高。通过LDN-57444（LDN）对UCHL1进行基因缺陷或药理学抑制，能够通过靶向葡萄糖-6-磷酸异构酶（Gpi）的降解并抑制Gpi介导的糖酵解，抑制氧化应激和M1巨噬细胞极化，从而赋予针对SILI的保护作用。相比之下，Gpi的过表达逆转了UCHL1缺陷对脓毒症的抑制作用。骨髓移植结合体外研究进一步表明，髓系UCHL1缺陷同样通过抑制Gpi稳定和糖酵解来改善SILI。因此，靶向髓系细胞中的UCHL1成为一种针对SILI的保护策略，凸显了其作为患者护理新型治疗途径的潜力。
脓毒症是由免疫反应失调引起的致命性多器官衰竭综合征，具有极高的死亡率。肝脏作为免疫代谢枢纽，在驱动脓毒症多器官衰竭中起关键作用。脓毒症诱导的肝损伤（SILI）在脓毒症患者中发病率极高且常导致严重肝衰竭，死亡风险显著。SILI由病原体直接损伤或全身炎症反应引起的继发肝损伤所致，其发病机制涉及代谢紊乱、炎症级联反应和细胞死亡等复杂的多因素交互网络，目前临床上尚无特异性的治疗干预手段。泛素-蛋白酶体系统（UPS）负责维持蛋白质稳态，其中去泛素化酶（DUB）能够动态逆转底物的泛素化修饰。泛素C端水解酶1（UCHL1）作为一种重要的DUB，可从底物蛋白上催化切割泛素分子，在肝脏疾病中发挥重要作用。然而，UCHL1在SILI期间髓系细胞中的具体功能尚属未知。为解决这一问题，研究人员探讨了靶向髓系UCHL1是否能够改善SILI，并深入揭示了其调控巨噬细胞极化和糖酵解代谢的具体分子机制。研究得出结论，髓系细胞中的UCHL1在脓毒症期间通过调控特定底物的泛素化修饰促进炎症反应，而靶向抑制该分子能显著减轻肝损伤。这一发现不仅阐明了UCHL1在脓毒症免疫代谢调控中的核心作用，还为临床防治SILI提供了全新的潜在治疗干预靶点。该论文发表在《Biochemical Pharmacology》期刊。
研究人员为开展此项研究使用的主要关键技术方法包括：利用野生型（WT）和UCHL1全身敲除（UCHL1-KO）小鼠构建盲肠结扎穿刺（CLP）多微生物脓毒症模型进行体内分析；采用骨髓移植技术构建骨髓嵌合小鼠以特异性评估髓系UCHL1的作用；运用免疫沉淀联合液相色谱-串联质谱（IP-LC-MS/MS）、免疫共沉淀和蛋白质印迹技术鉴定并验证UCHL1与靶蛋白的相互作用及K48连接的泛素化修饰机制；通过RNA测序和生物信息学分析揭示相关的信号通路改变；使用重组腺相关病毒9型（rAAV9）和重组腺病毒在体内和体外过表达靶蛋白；结合qPCR、ELISA和多种生化检测评估肝脏功能、炎症因子、氧化应激指标以及糖酵解代谢通路的改变。
UCHL1表达在脓毒症中上调
研究人员通过构建CLP小鼠模型发现，CLP手术后6至24小时小鼠肝脏组织中的UCHL1在mRNA和蛋白表达水平均显著上调。通过免疫荧光共染色分析证实，UCHL1不仅与肝脏和骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）中的Mac-2
+巨噬细胞共定位，而且在CLP手术或LPS刺激后其表达显著升高，表明UCHL1在SILI的发病机制中具有重要意义。
UCHL1缺陷减轻CLP诱导的肝功能障碍和损伤
研究人员利用WT和UCHL1-KO小鼠进行CLP手术以评估UCHL1的作用。结果显示，UCHL1缺失能够显著降低CLP引起的血清天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）活性升高，并恢复白蛋白（ALB）浓度。同时，UCHL1缺陷逆转了CLP诱导的肝细胞凋亡、活性氧（ROS）积聚和巨噬细胞浸润。免疫荧光和分子检测表明，UCHL1缺失抑制了M1巨噬细胞极化标志物（如iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β）的表达，同时促进了M2巨噬细胞极化标志物（如CD206、IL-10、YM1、ARG1）的表达。此外，UCHL1缺陷显著改善了CLP引起的血清丙二醛（MDA）水平升高和超氧化物歧化酶（SOD）水平降低，表明其能有效缓解肝脏氧化应激损伤。
BMDCs中UCHL1缺陷减轻CLP诱导的肝功能障碍和损伤
鉴于UCHL1在多种细胞类型中广泛表达，研究人员进一步通过骨髓移植构建了骨髓嵌合小鼠模型，以确认髓系细胞中UCHL1在SILI中的特异性作用。将WT或UCHL1-KO小鼠的骨髓来源细胞（BMDCs）移植给受体小鼠后进行CLP手术。结果表明，接受UCHL1-KO BMDCs的小鼠较接受WT BMDCs的小鼠显示出显著的肝脏功能改善、细胞凋亡减少、氧化应激降低和炎症水平下降。此外，髓系UCHL1缺陷同样逆转了巨噬细胞的极化失衡，抑制了M1极化并促进了M2极化，证实了髓系特异性UCHL1缺失在对抗CLP诱导的肝功能障碍和损伤中具有关键保护作用。
UCHL1与Gpi发生强相互作用
为了阐明UCHL1改善SILI的机制，研究人员在BMDMs中进行了IP-LC-MS/MS分析，鉴定出葡萄糖-6-磷酸异构酶（Gpi）为UCHL1的首要互作蛋白。通过免疫共沉淀实验证实，UCHL1能够特异性地与内源性Gpi结合。进一步的结构域映射实验表明，在HEK293T细胞中，UCHL1的1-90位氨基酸和Gpi的101-295位氨基酸是介导两者直接结合的关键区域。
UCHL1通过抑制赖氨酸（K）48连接的泛素链来抑制Gpi的泛素化和降解
不同形式的泛素化对目标蛋白产生不同影响，其中赖氨酸48（K48）连接的泛素链主要介导蛋白酶体降解途径。研究发现，在CLP手术后的肝脏和LPS刺激的BMDMs中，UCHL1缺失导致总泛素化和K48连接的泛素化修饰水平显著增加，Gpi蛋白水平显著降低，而对K63连接的泛素化水平无显著影响。放线菌酮追踪实验显示，UCHL1缺陷缩短了Gpi蛋白的半衰期。蛋白酶体抑制剂MG132能够恢复LPS刺激的UCHL1-KO BMDMs中降低的Gpi蛋白水平，证实UCHL1通过切割K48连接的泛素链拮抗Gpi的泛素化降解，从而稳定Gpi蛋白。
Gpi过表达加剧了UCHL1-KO小鼠中CLP诱导的肝功能障碍和损伤
为验证Gpi介导了UCHL1缺陷对SILI的保护作用，研究人员通过尾静脉注射rAAV9-Gpi在体内过表达Gpi。在CLP手术后，Gpi过表达显著逆转了UCHL1-KO小鼠的肝损伤改善情况：再次引发了促炎因子TNF-α、IL-6和IL-1β的产生，加重了肝脏氧化应激，并促进了M1巨噬细胞极化，同时抑制了M2极化。此外，在WT小鼠中过表达Gpi加剧了CLP诱导的肝损伤。表明UCHL1缺陷在体内对CLP引发的肝脏损伤的保护机制依赖于抑制Gpi介导的信号通路。
UCHL1通过依赖Gpi的信号传导调节LPS诱导的巨噬细胞M1极化和肝细胞损伤
研究人员利用重组腺病毒在BMDMs中特异性过表达Gpi，并将巨噬细胞与原代肝细胞共培养。研究结果表明，在LPS刺激下，UCHL1缺失的BMDMs显著抑制了促炎因子的分泌和ROS产生，减轻了共培养体系中肝细胞的AST/ALT释放、细胞凋亡和氧化应激。然而，Gpi的过表达成功逆转了这些因UCHL1缺陷所带来的肝脏保护和抗炎作用。这一发现证实，UCHL1缺陷依赖于Gpi信号通路的调节，从而有效抑制LPS诱导的M1巨噬细胞极化及其继发的肝细胞损伤。
UCHL1缺陷通过调节Gpi依赖的信号传导抑制SILI的糖酵解过程
研究人员对CLP手术后WT和UCHL1-KO小鼠肝脏进行了RNA测序分析及KEGG功能富集分析。结果显示，在UCHL1-KO小鼠肝脏中，与糖酵解/糖异生、ROS和凋亡相关的基因表达受到抑制，而氧化磷酸化通路亢进。免疫印迹证实，UCHL1缺陷显著降低了CLP或LPS诱导的Gpi、丙酮酸激酶M2（PKM2）和乳酸脱氢酶A（LDHA）等核心糖酵解酶的表达，同时纠正了肝脏和巨噬细胞中Gpi活性增加、乳酸积累和葡萄糖消耗的代谢偏移现象。在体外过表达Gpi消除了UCHL1缺失介导的巨噬细胞糖酵解抑制效应，确证UCHL1缺陷通过削弱依赖Gpi的信号轴来抑制巨噬细胞异常糖酵解，从而保护免受SILI。
给予LDN通过抑制Gpi调节的糖酵解途径改善CLP诱导的肝损伤
为了验证UCHL1作为治疗靶点的潜力，研究人员在CLP术前和术后向WT小鼠腹腔注射了UCHL1特异性抑制剂LDN-57444（LDN）。给药后，LDN有效预防了CLP引起的血清AST和ALT活性升高，显著降低了小鼠死亡率、细菌负荷以及血清PCT水平。在病理和分子机制上，LDN干预显著减少了肝脏组织中的细胞凋亡、ROS产生和促炎因子风暴，并下调了Gpi、PKM2和LDHA的表达，阻断了糖酵解途径的过度激活，再次特异性确证了靶向药理学抑制UCHL1对SILI的有效保护作用。
讨论部分总结
本研究确定了髓系特异性的UCHL1是SILI发病机制中一个新的关键调节因子。在分子机制层面上，UCHL1通过抑制K48连接的多聚泛素链修饰，阻止了Gpi蛋白的泛素化和蛋白酶体降解过程，稳定了Gpi蛋白表达。这种翻译后修饰调控显著激活了下游的巨噬细胞糖酵解途径，从根本上促进了M1巨噬细胞极化，显著增强了促炎细胞因子风暴和ROS的产生，最终加剧了脓毒症后的肝损伤。靶向抑制髓系细胞中的UCHL1能够干扰此病理代谢重编程过程，为脓毒症引发的肝功能障碍提供了潜在的治疗手段。总体结论表明，髓系细胞中UCHL1的缺陷通过靶向促进Gpi泛素化降解、抑制Gpi介导的糖酵解通路，从而抑制氧化应激和巨噬细胞M1极化，进而显著改善了脓毒症诱导的肝损伤，揭示了髓系UCHL1在SILI治疗中的关键保护作用。
