《Biomaterials》：Rethinking the PSMA-Mediated Tumor Targeting of Nanocarrier and Potentiating Co-delivery of PARP/EZH2 Inhibitors for Robust Prostate Cancer Treatment
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摘要配体介导的前列腺特异性膜抗原（PSMA）靶向策略是前列腺癌治疗中的重要方法。然而，传统上基于血管渗漏导致的被动增强渗透与滞留效应，再结合主动受体介导的摄取机制的PSMA靶向纳米药物作用方式，如今面临着直接内皮运输这一新证据的挑战。在此，我们通过肽修饰方法开发出一种PSMA靶向
摘要
配体介导的前列腺特异性膜抗原（PSMA）靶向策略是前列腺癌治疗中的重要方法。然而，传统上基于血管渗漏导致的被动增强渗透与滞留效应，再结合主动受体介导的摄取机制的PSMA靶向纳米药物作用方式，如今面临着直接内皮运输这一新证据的挑战。在此，我们通过肽修饰方法开发出一种PSMA靶向的硅质体，与无靶向对照组相比，该硅质体在皮下、原位及骨转移性前列腺癌模型中表现出更强的肿瘤聚集能力。超微结构透射电子显微镜观察以及体内竞争性阻断实验表明，在没有血管渗漏、EPR效应受限的情况下，这种硅质体能够同时利用非受体途径和依赖PSMA的主动跨细胞转运机制穿过内皮细胞并进入肿瘤组织，且细胞摄取效率更高。为探究这种主动靶向策略在转移性去势抵抗性前列腺癌中的治疗潜力，我们将PARP抑制剂鲁卡帕利布和EZH2抑制剂他泽美托司共同封装到该硅质体中，以协同诱导DNA损伤并引发细胞凋亡。在皮下及原位模型中，这种硅质体载体展现出的抗肿瘤效果均优于无靶向制剂。此外，这两种抑制剂的联合使用还能上调PD-L1表达并促进细胞毒性T细胞的浸润，因此与免疫检查点阻断疗法联用后，能在原位模型及复杂的骨转移小鼠模型中取得更好的治疗效果。总体而言，这项研究为前列腺癌的治疗提供了新的策略，并为设计高效肿瘤药物递送的配体介导纳米药物提供了理论依据。
引言
前列腺癌是全球男性中最常见的恶性肿瘤之一。虽然局部病变通常可以控制，但疾病进展到晚期并最终发生转移才是导致患者死亡的主要原因，同时也给治疗带来了巨大挑战。尽管雄激素剥夺疗法最初效果显著，但几乎所有患者最终都会发展成转移性去势抵抗性前列腺癌。目前针对晚期疾病的治疗方法仍然十分有限，这就迫切需要能够有效针对已扩散的肿瘤并突破现有治疗耐药机制的新疗法。
为满足这一需求，利用癌细胞上过度表达的分子靶标来实现精准药物递送是一种极具前景的方法。在转移性去势抵抗性前列腺癌中，前列腺特异性膜抗原的高表达使其成为治疗应用中的关键靶标。受到诸如177Lu-PSMA-617这类PSMA靶向小分子在临床上的成功应用启发，纳米药物设计领域逐渐采用配体-受体相互作用来增强对肿瘤的主动靶向能力。传统上，这种主动靶向的效果被认为源于两步过程：首先通过增强渗透与滞留效应在肿瘤间质中被动积累，随后再通过PSMA介导被细胞摄取。然而，最新研究显示，纳米颗粒的转移并非如预期那样通过渗漏的肿瘤血管实现，而是更多依赖于纳米颗粒的主动跨内皮转运，比如微胞饮作用。这些发现引出了一个关键且尚未解决的问题：对于那些采用配体介导主动靶向设计的纳米载体而言，配体仅仅是作为引导肿瘤细胞结合的“定位装置”，还是真正起到了调控纳米颗粒跨血管内皮细胞转运的作用？弄清这一机制对于设计具有更高递送效率的纳米药物至关重要。尤其是在前列腺癌中，PSMA不仅在肿瘤细胞中高表达，而且在肿瘤血管内皮中也有一定水平的表达。因此，有必要阐明PSMA靶向配体的修饰如何调节纳米颗粒在血液循环过程中与血管内皮的相互作用，以及它是如何引发一种不同于传统EPR效应的跨内皮转运机制的。
除了优化药物递送之外，选择一种能够有效应对转移性去势抵抗性前列腺癌治疗挑战的药物载荷也同样重要。聚ADP-核糖聚合酶抑制剂通过利用合成致死效应，针对同源重组修复缺陷，在治疗转移性去势抵抗性前列腺癌方面展现了显著的临床效果。不过，由于多种因素如同源重组修复功能依然存在、剂量限制性的血液系统毒性以及异常的表观遗传调控，这类抑制剂常常会出现原发性和获得性耐药性。越来越多的证据表明，表观遗传失调是推动转移性去势抵抗性前列腺癌进展以及其对内分泌疗法和PARPi类药物产生耐药性的关键因素。EZH2蛋白可以通过催化组蛋白H3第27位的三甲基化作用，从而表观遗传地沉默肿瘤抑制基因。重要的是，EZH2的功能对于维持同源重组修复能力也是不可或缺的。通过药物抑制EZH2活性，就可以干扰这一修复途径，进而引发所谓的“BRCAness”表型。由于PARP抑制剂会将PARP蛋白固定在DNA损伤部位，从而将单链断裂转化为双链断裂，而EZH2抑制所带来的同源重组修复功能缺失，又会进一步增加细胞对PARP抑制剂的敏感性。鲁卡帕利布是一种已被批准用于治疗具有同源重组修复基因突变的转移性去势抵抗性前列腺癌的PARPi抑制剂，而他泽美托司则是一种高选择性的EZH2抑制剂，可在临床前模型中逆转表观遗传沉默作用，二者结合使用堪称理想的协同组合。为了在体内发挥这种协同效应并克服药物递送方面的难题，使用纳米载体将这两种药物共同封装起来进行靶向递送，无疑是一种极具前景的策略。
基于以上考虑，我们合理设计了一种PSMA靶向纳米载体，即将PSMA靶向肽配体ACUPA连接到我们之前开发的硅质体平台上，将其命名为tSil（见图1）。这种未经配体修饰的硅质体由介孔二氧化硅纳米颗粒构成，表面覆盖有脂质双层，不仅能够高效装载药物，还能延长其在体内的循环时间，而且已经在肿瘤模型以及炎症性肌肉疾病模型中通过主导的跨细胞转运途径实现了有效的药物递送。在本研究中，我们进一步探讨了在硅质体上添加PSMA配体对其在前列腺癌模型中的肿瘤特异性聚集以及癌细胞内部摄取能力的影响。通过组织超微结构透射电子显微镜分析，我们发现了两种跨细胞转运机制，即tSil同时利用了大胞饮作用和受体介导的跨细胞转运作用，从而显著提升了其跨内皮转运的能力。该硅质体平台还支持通过远程加载方式将鲁卡帕利布和他泽美托司共同封装到介孔二氧化硅纳米颗粒的核心结构中，由此形成了名为tSil-RT的药物载体制剂。在皮下及原位模型中，这种tSil-RT制剂展现出的抗肿瘤效果均优于无靶向制剂。我们还证实，tSil-RT制剂不仅能发挥强大的细胞毒性，还具有免疫调节作用，能够促进免疫细胞向肿瘤组织的浸润。最后，我们的研究结果表明，这种策略所重塑的肿瘤微环境显著提高了肿瘤细胞对免疫检查点阻断疗法的敏感性，无论是在原位模型还是转移性前列腺癌模型中都是如此，由此为这种新型联合治疗策略的临床应用奠定了基础。
章节节选
构建高效细胞摄取能力的PSMA靶向tSil纳米平台
这种tSil纳米载体是通过在硅质体上添加PSMA靶向肽配体ACUPA而制备得到的（见图1a）。首先，我们采用溶胶-凝胶法合成了未经修饰的介孔二氧化硅纳米颗粒。透射电子显微镜图像显示，这些纳米颗粒具有清晰的形态和均匀的大小分布，平均粒径约为75纳米（见图S1）。随后，我们用由DSPC、胆固醇以及DSPE-PEG2k-MAL按特定摩尔比组成的脂质复合物对这些纳米颗粒进行了包覆。
结论
尽管PSMA靶向纳米药物已经得到了广泛的研究，但决定其递送优势的机制至今仍未完全明确。在本研究中，我们构建了一种经过PSMA功能化的硅质体纳米平台，旨在阐明其实现肿瘤递送的跨血管传输过程。我们的研究结果表明，PSMA靶向作用不仅仅局限于肿瘤细胞的识别，它还能够促进跨内皮转运，从而在被动EPR效应之外，进一步提升药物穿过血管屏障的递送效率。
材料与方法
材料。三乙醇胺、正硅酸乙酯以及(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷均从Aladdin公司购买；三水合氯金(III)酸盐和二水合柠檬酸钠则购自Macklin公司。1,2-二硬脂酰--sn-甘油-3-磷酸胆碱以及胆固醇来自SunLipo NanoTech公司。1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[马来酰亚胺聚乙二醇-2000]则由其他供应商提供。
CRediT作者贡献说明
王浩阳：项目管理、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。 刘向生：论文撰写与修改、结果可视化、实验验证、研究监督、项目管理、方法学设计、实验研究、资金获取、数据分析、数据整理、概念构思。 黄强：论文撰写与修改、初稿撰写、结果可视化、实验验证、软件应用、资源准备、项目管理、实验研究、数据分析、数据整理。
利益冲突声明
? 作者们声明存在以下可能被视为利益冲突的财务利益或个人关系：莫张拥有自己正在申请的专利。其他作者则声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本项研究得到了中国国家自然科学基金的支持（X.L.对应的课题编号为32471438，M.Z.对应的课题编号为82173372）。X.L.还感谢浙江省自然科学基金（项目编号为LDQ24B020002）以及杭州医学院浙江癌症医院和中国科学院提供的启动资金支持。M.Z.则感谢辽宁省教育厅的资助（项目编号为LJKMZ20221138），以及辽宁省用于支持本地科学研究与技术发展的相关资金。
黄强|李玉婷|毕一凡|张佳|江伟|王浩阳|赵军|杨红红|施夏雨|江金洪|杨菲雅|刘向生|张莫
中国医科大学第一医院泌尿外科，中国辽宁省沈阳市南京街155号，邮编110001
