通过添加疏水性氨基酸末端标签，将细胞穿透肽从“递送剂”转变为“执行剂”，以对抗细胞内细菌感染

《Biomaterials》：Switching cell-penetrating peptides from "deliverer" to "enforcer" by hydrophobic amino acid end-tagging to combat intracellular bacterial infections

　　

摘要：

难以杀灭的胞内细菌以及抗菌素耐药性问题给全球公共卫生带来了巨大挑战。抗菌肽和细胞穿透肽分别在对抗多重耐药菌及药物递送方面发挥着不可替代的作用，但如何结合两者的优势来设计用于对付胞内细菌的肽基生物材料仍是一项艰巨任务。本研究基于转录激活因子Tat，结合抗菌肽的末端修饰与结构-活性关系，构建了一个包含30种兼具抗菌性与细胞穿透功能的微型肽库。通过肽库筛选得到的候选肽5VT展现出强大的活性，可有效杀伤临床分离出的耐药菌株，同时具有优异的生物相容性。值得注意的是，5VT主要通过网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用进入细胞，能够消灭胞内的鼠伤寒沙门氏菌并减轻炎症反应。此外，5VT还通过双重机制杀死细菌，即破坏细菌细胞膜并引发活性氧的异常生成。进一步的体内实验表明，5VT没有系统性毒性，在腹膜炎-败血症模型中具有显著的治疗效果。本研究为将阳离子型细胞穿透肽从“递送载体”转变为对抗胞内细菌的“多功能武器”提供了简单有效的策略，也为设计开发用于应对日益增多的胞内细菌和多重耐药菌的肽基抗菌材料带来了新思路。

引言

胞内细菌会侵入宿主细胞并逃避宿主免疫机制以生存和繁殖，从而引发慢性或持续性感染，严重威胁全球公共卫生安全[1]、[2]。不幸的是，除了鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌这类传统意义上的胞内细菌外，越来越多的证据表明，大肠杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌等传统上的胞外细菌也具备侵入宿主细胞的能力，这一现象在多种细胞类型中都有发现，尤其是巨噬细胞和上皮细胞[3]、[4]、[5]、[6]。尽管抗生素在对抗细菌感染中起着不可或缺的作用，但由于大多数临床获批的抗生素难以穿透细胞、在细胞内的积累不足且滞留时间短，因此很难彻底消灭胞内细菌[7]。虽然以细胞穿透肽为代表的递送系统已成功地将现有抗生素递送到胞内细菌所在位置[7]、[8]，但随着细菌耐药性的不断演变，这一策略的有效性可能在未来逐渐丧失[9]、[10]。因此，迫切需要设计开发新的抗菌化合物来对抗胞内细菌，尤其是那些具有与传统抗生素不同抗菌机制的化合物，因为这类化合物较不易引发细菌耐药性，是当前抗菌化合物研究中的重要方向。

与细胞穿透肽同属膜活性肽家族的抗菌肽也引起了我们的关注[11]、[12]。由于其具有多种难以诱发细菌耐药性的抗菌机制，尤其是能够破坏细菌细胞膜，抗菌肽被视为抗生素的理想替代品[13]、[14]、[15]。然而，与细胞穿透肽相比，大多数抗菌肽缺乏有效穿透哺乳动物细胞膜的能力[16]、[17]、[18]。我们发现，具有强抗菌活性的抗菌肽通常具有阳离子性和疏水性的两亲性特征[19]、[20]，而具有高效细胞穿透能力的阳离子型细胞穿透肽则富含大量阳离子氨基酸残基[17]。受此启发，我们推测通过对阳离子型细胞穿透肽进行基于抗菌肽结构-活性关系的疏水修饰，使其在保留细胞穿透能力的同时具备抗菌活性，可能是一种简单有效的针对胞内细菌的策略。

在本研究中，我们结合抗菌肽的末端修饰与结构-活性关系，构建了一个包含30种兼具抗菌性与细胞穿透功能的微型肽库（见图1）。具体而言，我们选择了经典的阳离子型细胞穿透肽转录激活因子Tat，它不仅具备基本的细胞穿透能力，还能与细菌细胞膜上的负电荷成分相互吸引[20]、[21]。此外，在Tat的N端或C端添加不同种类和数量的疏水氨基酸残基，不仅可以提高肽与细菌细胞膜的亲和力[19]、[22]，增强其在生理环境中的稳定性[23]、[24]，还能提升肽穿透哺乳动物细胞膜的效果[25]、[26]。虽然疏水末端修饰已被用于增强抗菌肽对胞外细菌的抗菌活性和稳定性[23]、[27]，但其对胞内细菌的效力尚未得到研究。通过上述设计策略，我们将Tat从单纯的“递送载体”转变成了对抗胞内细菌的“多功能武器”。从肽库中筛选得到的候选肽5VT对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均表现出强大活性，包括临床分离出的耐药菌株，同时具有良好的生物相容性。5VT不仅在生理盐水和血清中能保持稳定的抗菌活性，还具有不易引发细菌耐药性和杀菌速度快的特点。此外，5VT主要通过巨胞饮作用和网格蛋白介导的内吞作用进入细胞，能够消灭胞内的鼠伤寒沙门氏菌并减轻炎症反应。对5VT抗菌机制的研究表明，它主要通过双重机制杀死细菌，即破坏细菌细胞膜并引发活性氧的异常生成。令人惊喜的是，5VT在小鼠体内的安全性很高，在鼠伤寒沙门氏菌感染的腹膜炎-败血症模型中具有显著的治疗效果，能够有效消灭细菌并减轻炎症反应。总之，我们所提出的方法能够简单高效地将细胞穿透肽转化为对抗胞内细菌的强力武器。

章节节选

肽的设计、合成与表征

本研究提出了一种简单高效的方案，用于对抗胞内细菌感染。该方案通过结合抗菌肽的末端修饰与结构-活性关系，将仅具有细胞穿透功能的细胞穿透肽转变为兼具细胞穿透功能和抗菌功能的“多功能武器”。具体来说，根据抗菌肽的结构-活性关系，适宜的正电荷和疏水性往往是其发挥抗菌活性的关键特性。

讨论

由于复杂的胞内细菌感染问题以及日益严重的抗菌素耐药性，研发新型抗菌化合物显得尤为重要。至今，抗生素在控制细菌感染方面仍发挥着不可替代的作用。但由于其细胞渗透性有限，抗生素在治疗胞内细菌感染方面效果不佳[7]。虽然以细胞穿透肽为代表的递送系统已成功地将现有抗生素递送到胞内细菌所在位置

化学合成与分析

所有肽都是通过固相肽合成法制备的。随后，利用ESI-MS检测了这些肽的分子量，并通过HPLC纯化，纯度达到了95%以上。

圆二色光谱分析

将这些肽分别用PBS（浓度为10 mM，pH值为7.4）、TFE（浓度为50%）和SDS（浓度为30 mM）稀释至150 mM，然后加入直径为0.5毫米的石英比色皿中。在室温下使用Chirasca型圆二色光谱仪在195-250纳米波长范围内进行了三次扫描。

CRediT作者贡献说明

王梦成：撰写——审阅与编辑、方法学、实验研究。朱永杰：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化分析、方法学、实验研究、资金获取、正式分析、概念构思。程宝晶：撰写——审阅与编辑、方法学、实验研究。庞建安：撰写——审阅与编辑、方法学、实验研究。单安山：撰写——审阅与编辑、监督工作、资源提供、资金获取、概念构思。秦华秀：

利益冲突声明

作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性

数据将应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：U25A20708、32272914）、中国国家重点研发计划（项目编号：2022YFD1300700）、中国博士后科学基金会博士后 fellowship项目（项目编号：GZB20250821）、中国博士后科学基金会（项目编号：2025MD784077）以及黑龙江省博士后科学基金会（项目编号：LBH-Z24095）的支持。

朱永杰|王梦成|秦华秀|庞建安|程宝晶|邵长轩|李金龙|单安山

中国东北农业大学动物科技学院，哈尔滨150030