《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Chemical synthesis and biological activity of semisynthetic derivatives against Chagas disease and leishmaniasis composed of fragments of natural products and 1,2,3-triazine 1-oxide scaffold
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恰加斯病和利什曼病是由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）和利什曼原虫（Leishmania sp.）引起的被忽视疾病，每年导致全球发病率和死亡率上升，影响超过600万人。尽管现有治疗方案可用，但其疗效低且不良反应多，促使研究人员设计和开发新药。天然
恰加斯病和利什曼病是由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）和利什曼原虫（Leishmania sp.）引起的被忽视疾病，每年导致全球发病率和死亡率上升，影响超过600万人。尽管现有治疗方案可用，但其疗效低且不良反应多，促使研究人员设计和开发新药。天然产物与杂环骨架的杂交已成为获得具有抗寄生虫活性的新药的分子编辑策略。在本项目中，研究人员设计、合成了一系列新的半合成4-羧酸酯-1,2,3-三嗪1-氧化物衍生物，并评估了其对两株T. cruzi和墨西哥利什曼原虫（L. mexicana）的体外和体内活性。化合物TS-14在1,2,3-三嗪1-氧化物环的4位具有香叶酯基、5位具有乙基，对Ninoa株（IC50=1.75 μM）和A1株（IC50=1.16 μM）的杀锥虫活性优于参考药物苄硝唑（分别为IC50=30.3 μM和39.8 μM）和硝呋莫司（分别为IC50=7.09 μM和19.3 μM）。此外，TS-14在体内模型中使T. cruzi锥鞭毛体的寄生虫血症降低了40.4%。化合物TS-16在4位具有香叶酯基、5位具有正戊基，对FCQEPS株（IC50=12.97 μM）和M379株（IC50=2.11 μM）的杀利什曼原虫活性优于参考药物葡萄糖锑胺（分别为IC50=125.23 μM和133.96 μM）。此外，TS-21和TS-30在体内试验中使L. mexicana的寄生虫血症降低幅度最大（分别为60%和64.1%）。最后，化合物TS-14和TS-32对T. cruzi的锥虫硫酮还原酶（TcTryR）表现出非竞争性抑制作用，化合物TS-32对T. cruzi的锥虫硫酮合成酶（TcTryS）亦如此。本研究代表了将天然产物片段与1,2,3-三嗪1-氧化物骨架杂化作为开发针对T. cruzi和L. mexicana等寄生虫药物的新选择的创新案例。
研究背景方面，被忽视热带病（Neglected Tropical Diseases, NTDs）每年影响全球超过10亿人，其中恰加斯病由克氏锥虫（Trypanosoma cruzi）引起，影响约600万至700万人，年死亡1.2万人，现有参考药物苄硝唑（benznidazole）和硝呋莫司（nifurtimox）仅在急性期有效且不良反应多导致停药；利什曼病由利什曼原虫（Leishmania）物种引起，标准治疗用五价锑剂如葡萄糖锑胺（glucantime）同样存在低效和不良反应问题。N-杂环化合物如三嗪类具抗寄生虫潜力，但1,2,3-三嗪衍生物在此领域探索较少，而天然产物及其片段具多样生物活性，杂化策略可改善药代性质，因此研究人员开展此项研究以开发新抗寄生虫候选药物。研究人员设计并半合成了48种新的4-羧酸酯-1,2,3-三嗪1-氧化物衍生物，通过体外体内评价活性、结构-活性关系（Structure-Activity Relationship, SAR）矩阵分析、定量蛋白质组学、酶动力学及计算机模拟（in silico）ADMET（Absorption, Distribution, Metabolism, Excretion, Toxicity）预测等手段，发现化合物TS-14对T. cruzi具优异杀锥虫活性且在体内降低寄生虫血症40.4%，TS-16对L. mexicana体外活性优于参考药，TS-21和TS-30在体内分别降低寄生虫血症60%和64.1%，TS-14和TS-32非竞争性抑制TcTryR，TS-32抑制TcTryS，研究首次报道此类杂化衍生物的抗寄生虫活性，为药物开发提供新方向，论文发表于《Biomedicine》。
主要关键技术方法包括：使用商业易得植物次级代谢产物经三步合成2-重氮乙酸酯衍生物，再与乙烯基重氮化合物加叔丁基亚硝酸酯反应制得48种目标衍生物并经核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）和高分辨质谱（High-Resolution Mass Spectrometry, HRMS）表征；体外抗锥虫活性用T. cruzi Ninoa和A1株（属TcI离散分型单位Discrete Typification Unit, DTU）表鞭毛体以MTT法测IC50，体外抗利什曼活性用L. mexicana FCQEPS和M379株前鞭毛体同法测定，细胞毒性用J774.2巨噬细胞系测CC50算选择性指数（Selectivity Index, SI）；体内急性T. cruzi感染用CD1小鼠腹腔接种Ninoa株锥鞭毛体，口服TS-14或苄硝唑后测不同时间点寄生虫血症，体内皮肤利什曼病用BALB/c小鼠左后足垫接种L. mexicana前鞭毛体，腹腔给药后测病变面积和寄生虫负荷；定量蛋白质组学用LC-MS/MS分析TS-14处理的T. cruzi表鞭毛体差异表达蛋白；酶抑制试验测重组TcTryR和TcTryS的动力学参数及化合物抑制类型与Ki值；计算机模拟用Swiss ADME和ProTox-II预测ADMET，UPLC-MS测TS-14、TS-21、TS-30在人血浆中稳定性；结构-活性关系矩阵（Structure-Activity Relationship Matrix, SARM）和活性景观图分析取代基与活性关联。
研究结果部分保留小标题说明如下。2.1 Synthesis合成方面，研究人员用12种商业植物初级次级代谢产物制得2-重氮乙酸酯衍生物（D1-D12，产率50%-94%），用4种含酮基初级代谢产物调控5位取代基，经乙烯基重氮化合物与叔丁基亚硝酸酯反应以50%-92%产率获得48种新半合成4-羧酸酯-1,2,3-三嗪1-氧化物衍生物，所有化合物经1H NMR、13C NMR和HRMS表征，重氮乙酸酯质子信号4.7-4.8 ppm，三嗪环6位质子信号7.80-8.16 ppm，含芳香酯基者在7.0-7.5 ppm有信号。2.2 Trypanocidal activity杀锥虫活性方面，重氮乙酸酯衍生物无活性，48种衍生物对T. cruzi Ninoa和A1株活性各异，TS-14（4位香叶酯、5位乙基）活性最高（Ninoa IC50=1.75 μM，A1 IC50=1.16 μM）优于参考药；2.2.1 Structure-Activity Relationship Matrix (SARM)结构-活性关系矩阵表明Ninoa株偏好4位香叶基、对甲基苄基等及5位乙基或正戊基，A1株偏好4位橙花基、香茅基等及5位甲基或乙基，TS-14与TS-18因R2反式与顺式构型差异致活性悬殊，存活性悬崖（activity cliffs）；2.2.1.1 In vivo trypanocidal activity against T. cruzi体内抗T. cruzi活性中TS-14在急性感染小鼠模型2小时降寄生虫血症25%、4小时降40.4%并维持至8小时，苄硝唑2小时约11%、6-8小时达80%；2.2.1.2 Quantitative proteomic analysis定量蛋白质组学分析鉴定3430种蛋白，TS-14处理组1417种上调（FC>2）、337种下调（FC<1/2），上调蛋白多未表征（64.65%）及信号磷酸化调节（10.1%）、泛素-蛋白酶体（9.09%）、能量代谢（6.06%）等，下调蛋白多蛋白酶解相关（21.88%）及蛋白折叠应激（9.38%）、氧化应激、毒力转唾液酸酶等；2.2.1.5 Determination of the inhibitory effect of the compounds on recombinant TcTryR and TcTryS化合物对重组TcTryR和TcTryS抑制效应中，2.2.1.5.1 TcTryR显示TS-14（Ki=90±15 μM）和TS-32（Ki=21±4 μM）为非竞争性抑制，TS-17抑制弱（Ki=819±273 μM），TS-10无抑制；2.2.1.5.2 TcTryS显示仅TS-32有非竞争性抑制（Ki=198±36 μM），其余无抑制，酶抑制与细胞活性低相关暗示有其他靶点。2.3 Leishmanicidal activity杀利什曼活性方面，重氮衍生物D6、D8对M379株活性优于葡萄糖锑胺但细胞毒；48种衍生物对L. mexicana两株活性不同，TS-16（4位香叶酯、5位正戊基）最优（FCQEPS IC50=12.97 μM，M379 IC50=2.11 μM）优于参考药；2.3.1 Structure-Activity Relationship Matrix (SARM)结构-活性关系矩阵表明FCQEPS株偏好4位薄荷酯或香叶酯，M379株偏好香茅酯、紫苏酯或薄荷酯，5位正戊基一般活性好，TS-10与TS-6因R2香茅基与烯丙基差异失活，TS-16（反式香叶酯）优于TS-20（顺式橙花酯），5位正戊基优于正丁基；2.3.2 In vivo leishmanicidal activity体内杀利什曼活性中TS-16未降负荷，TS-21和TS-30分别降寄生虫血症60%和64.1%优于葡萄糖锑胺（49.85%），无动物中毒死亡；2.3.3 In silico ADMET prediction计算机模拟ADMET预测显示所有衍生物分子量～183–349 g/mol符合Lipinski规则，高胃肠吸收，部分透血脑屏障（Blood-Brain Barrier, BBB），非P-糖蛋白（P-gp）底物，多抑制CYP1A2/CYP2C19/CYP2D6/CYP3A4但不抑CYP2C9，无肝毒致癌细胞毒；2.3.3.1 Stability of compounds by UPLC-MS UPLC-MS化合物稳定性显示TS-14、TS-21、TS-30在人血浆12小时无降解产物，4位酯基未水解。
总结讨论部分，研究人员指出新半合成4-羧酸酯-1,2,3-三嗪1-氧化物衍生物具抗T. cruzi和L. mexicana活性，TS-14体外杀锥虫优参比药且体内短期降寄生虫血症40.4%，TS-16体外杀利什曼优参比药，TS-21和TS-30体内降L. mexicana寄生虫血症60%和64.1%，双键芳香异戊二烯末端基团提升活性；蛋白质组学显示氧化应激相关维护与适应机制蛋白丰度变化，TS-14和TS-32非竞争性抑TcTryR、TS-32抑TcTryS暗示干扰锥虫硫酮（trypanothione [T(SH)2]）抗氧化系统但酶与细胞活性低相关或有其他靶点，需DARTS（drug affinity responsive target stability）研究；本研究首次报道天然产物来源的此类衍生物抗两寄生虫活性，需进一步感染形式、细胞毒、药动药效研究证实潜力。研究结论部分翻译为：本研究中，新的半合成4-羧酸酯-1,2,3-三嗪1-氧化物衍生物被合成并表征具抗T. cruzi和L. mexicana活性，突出化合物TS-14对Ninoa和A1株杀锥虫活性优于参考药硝呋莫司和苄硝唑，并在短期体内小鼠模型中对T. cruzi锥鞭毛体降低寄生虫血症40.4%；另一方面，化合物TS-16对M379和FCQEPS株杀利什曼活性优于葡萄糖锑胺，化合物TS-21和TS-30在体内小鼠模型中对L. mexicana分别降低寄生虫血症60%和64.1%，有趣的是，带双键和芳香异戊二烯单元具末端基团的取代比其他取代改善抗寄生虫活性；根据蛋白质组分析，观察到参与细胞维护过程（翻译、代谢、蛋白转换）和氧化应激相关适应机制的蛋白相对丰度变化，此外TS-14和TS-32对TcTryR呈非竞争性抑制，TS-32对TcTryS亦然，这暗示半合成4-羧酸酯-1,2,3-三嗪1-氧化物衍生物可能作用机制的途径，然而酶活性测定与杀锥虫效应低相关暗示涉及其他药物靶点，因此需要开展如DARTS研究以识别与主作用机制相关的潜在蛋白靶点；本研究代表了首例从天然产物获得的具抗T. cruzi和L. mexicana活性的半合成4-羧酸酯-1,2,3-三嗪1-氧化物衍生物的报道，两种寄生虫感染形式、细胞毒、药动学和药效学研究有必要证实此类化合物对抗这两种被忽视疾病的治潜能。
