《Biosensors and Bioelectronics》：Chemical Additives-Enhanced CRISPR/Cas12a-based RNA Detection
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摘要CRISPR/Cas12a系统因其RNA引导的转切活性而彻底改变了分子诊断领域，这种活性使得核酸检测既具有可编程性又极为精准。不过，目前大多数基于Cas12a的检测方法都是为DNA靶标优化的，而直接检测RNA的灵敏度较低，通常仅为纳摩尔级别。为提升RNA分析的性能，现有方法往
摘要
CRISPR/Cas12a系统因其RNA引导的转切活性而彻底改变了分子诊断领域，这种活性使得核酸检测既具有可编程性又极为精准。不过，目前大多数基于Cas12a的检测方法都是为DNA靶标优化的，而直接检测RNA的灵敏度较低，通常仅为纳摩尔级别。为提升RNA分析的性能，现有方法往往需要额外的DNA激活剂或复杂的辅助系统。在此，我们提出一种简单有效的化学添加剂策略，可克服这些限制。这种经过化学添加剂增强的CRISPR/Cas12a基RNA检测方法无需DNA激活剂、逆转录或链置换反应，即可实现飞摩尔级别的RNA检测。值得注意的是，该方法还可用于单链DNA检测，达到阿摩尔级别。总体而言，该技术提供了一种简单、无需扩增且灵敏度极高的诊断框架，可轻松应用于其他CRISPR/Cas系统，以实现超灵敏的核酸检测。
引言
基于规则间隔短回文重复序列的CRISPR系统已成为实现可编程核酸识别与诊断的强大工具（Jiao等人，2021；Kaminski等人，2021）。其中，Cas12a因具备强大的转切活性、简单的引导RNA设计以及天然的信号放大能力而备受关注（Broughton等人，2020；Li等人，2018；Nguyen等人，2022；Zetsche等人，2020；Zhang等人，2021b）。这些特性使得人们能够开发出灵敏度较高且稳定的DNA检测方法，且往往不需要复杂的仪器设备（Chen等人，2025；Chen等人，2018；Munusamy等人，2025；Xiong等人，2020）。虽然从原理上讲，Cas12a核糖核蛋白能够识别RNA，但由于RNA结合只能引发较弱的转切活性，导致检测灵敏度较低（如UNIVERSE检测所示，通常为纳摩尔级别）（Deng等人，2024；Zhang等人，2024），因此直接检测RNA仍然具有挑战性。为此，大多数基于CRISPR/Cas12a的RNA分析方法都需要通过逆转录或链置换反应等额外的处理或扩增步骤来提升检测性能（Feng等人，2021；Wang等人，2022；Zhang等人，2021a）。尽管已有针对RNA检测的特定CRISPR酶，如Cas13变体，但它们无法直接用于DNA检测（Rananaware等人，2023）。此外，基于Cas13的检测方法中常用的RNA报告基因通常比DNA报告基因更不稳定，更容易发生降解，这给试剂储存、操作及检测方法的稳定性带来了更大挑战。迄今为止，还没有任何CRISPR系统能够通过转切作用同时检测DNA和RNA（Rananaware等人，2023），而使用未经修饰的Cas12a进行直接RNA检测也极为罕见，这凸显了开发更简单RNA检测平台的必要性。
近年来，人们通过设计特定的核酸相互作用，开发出了多种策略来克服Cas12a受RNA激活作用较弱的缺陷。其中包括SAHARA策略，它利用针对种子区域的短双链DNA激活剂来实现一步式RNA检测（Rananaware等人，2023）；FCAS策略，则借助片段化的单链DNA激活剂来实现飞摩尔级别的灵敏度并用于miRNA成像（Zhao等人，2024）；PHD策略则能让Cas12a识别结构极为复杂的超短RNA（Qiao等人，2025）。更为近期的是，通过引入单链DNA激活剂，基于分裂型crRNA的设计也成功实现了无需扩增的Cas12a直接RNA检测（Chen等人，2024；Fei等人，2025；Hu等人，2025；Jiang等人，2025；Zhang等人，2025）。为增强检测信号，还有基于竞争性crRNA结合的不对称CRISPR系统（Moon等人，2025）以及通过环状DNA线性化实现Cas12a自催化激活的AutoCAR系统（Deng等人，2024）被报道出来。尽管通过设计特定的核酸相互作用可以提升Cas12a对RNA的激活能力，但这些方法往往需要依赖额外的DNA激活剂、复杂的混合结构或多组分设计，从而增加了实验的复杂性，限制了其实际应用价值。各种现有RNA检测方法的性能对比详见补充表S1。
在此，我们发现简单的化学添加剂能够显著提升Cas12a本身由RNA触发的转切活性（见图1）。这种借助添加剂的策略不仅大幅提升了RNA检测的灵敏度，其性能也远超此前报道的直接RNA检测方法（纳摩尔级别灵敏度）（Li等人，2022；Zhang等人，2024），可实现飞摩尔级别的稳定检测。此外，同样的化学添加剂策略也可用于单链DNA检测。在优化条件下，甚至能够检测到阿摩尔浓度的DNA。总体而言，我们的研究揭示了一种简单却高效的提升Cas12a转切活性的方法，既有助于深入研究Cas12a的生物化学机制，也有助于开发更灵敏的核酸检测平台。
内容节选
材料与试剂
LbCas12a以及带有FAM标记的单链DNA报告探针，还有补充表S2中列出的DNA和RNA寡核苷酸，均从Integrated DNA Technologies公司（美国爱荷华州科拉维尔市）购买。10×NEbuffer 2.1则购自New England Biolabs公司（马萨诸塞州伊普斯威奇市）。本研究使用的其他所有化学品均来自Sigma-Aldrich公司（密苏里州圣路易斯市）。实验过程中始终使用超纯水。所有的DNA寡核苷酸和RNA样本都溶解在无DNase的溶液中，
研究化学添加剂对基于Cas12a的RNA检测的影响
由于各种化学物质能够稳定蛋白质并调节溶剂性质，进而影响反应动力学，因此它们被广泛用作溶剂添加剂，以提升生物传感技术的性能，包括灵敏度、选择性和稳定性。尽管这类添加剂已被用于提升基于CRISPR的DNA检测性能，但其在RNA分析中的应用潜力至今仍未得到充分挖掘（Cai等人，2017；Feng等人，2023；Li等人，2021；Lin等人）。
结论与未来展望
在本研究中，我们发现向反应缓冲液中添加Tween 20和甘油，能够显著提升Cas12a-crRNA系统直接检测RNA的灵敏度。这种CARD策略无需任何辅助成分或核酸扩增步骤，即可实现飞摩尔级别的RNA定量，从而解决了基于CRISPR的诊断技术中的一个关键问题——即Cas12a本身由RNA触发的转切活性较弱的问题。与以往的方法相比，
CRediT作者贡献说明
郑海燕：实验研究。孔建华：实验研究。Munusamy Sathishkumar：实验研究。Kanaherarachchi Anudha：实验研究。关 Lucas：实验研究。Jahani Rana：实验研究。周硕：实验研究。陈军：论文撰写——初稿编写、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思。关希云：论文撰写——审阅与编辑、项目监督、资源协调、项目管理、资金申请、概念构思
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了美国国家科学基金会的财政支持（编号：2345813）。
陈军|郑海燕|关Lucas|Kanaherarachchi Anudha|Munusamy Sathishkumar|孔建华|周硕|Jahani Rana|关希云
美国密苏里大学化学系，密苏里州哥伦比亚市，邮编65211
