《Zygote》：Establishing a safe and effective cleaning method for PDMS devices derived from 3D-printed resin moulds in embryo production
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用于体外胚胎生产（IVEP）的动态系统长期以来一直受到追求，以便更接近输卵管和子宫的生理条件。尽管在微流控领域已取得显著进展，但微流控器件的灭菌方案仍存在一些挑战。这一复杂性与聚二甲基硅氧烷（PDMS）中浸出的组分有关。PDMS是用于胚胎生产的软光刻技术中最安
用于体外胚胎生产（IVEP）的动态系统长期以来一直受到追求，以便更接近输卵管和子宫的生理条件。尽管在微流控领域已取得显著进展，但微流控器件的灭菌方案仍存在一些挑战。这一复杂性与聚二甲基硅氧烷（PDMS）中浸出的组分有关。PDMS是用于胚胎生产的软光刻技术中最安全的材料之一。然而，软光刻所需模具的使用可能影响胚胎培养。这一限制源于可用于3D打印模具的生物相容性树脂范围有限。虽然更换模具生产的生物材料并非直接选择，但研究人员假设，通过优化的清洗方案，可使由这些模具制造的PDMS器件具有生物相容性。在本研究中，研究人员评估了连续洗涤、超声处理和延长洗涤液孵育的效果。研究结果表明，将PDMS器件在添加抗生素和抗真菌药的磷酸盐缓冲液（PBS）中预孵育（4°C下48小时），再加上在体外培养（IVC）培养基中孵育（38.5°C下48小时），可使使用3D打印机模具制造的PDMS器件支持牛胚胎发育。这一优化方案支持了IVEP，其速率与标准条件相当，且未增加细胞凋亡或氧化应激，验证了其在辅助生殖技术应用中的适用性。
论文解读文章
**研究背景与问题**
动态微流控系统在体外胚胎生产（IVEP）中具有重要应用前景，能够模拟输卵管和子宫的生理环境，包括机械刺激、分子梯度及信号时序调控。然而，目前微流控器件的灭菌方案仍面临挑战，主要源于聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件中浸出的未交联化合物。尽管PDMS是软光刻中最安全的材料之一，但使用3D打印树脂模具制备PDMS时，模具中的树脂成分可能释放毒性物质，影响胚胎培养。由于商品化树脂成分未知且生物相容性树脂种类有限，直接更换模具材料并非可行方案。因此，研究人员提出通过优化清洗方案，使由3D打印树脂模具制备的PDMS器件具备生物相容性，从而推动动态IVEP系统的发展。本项研究旨在评估不同清洗方法，确立安全有效的清洗流程，为微流控器件在辅助生殖技术中的应用提供依据。论文发表在《Zygote》。
**主要技术方法**
研究人员采用软光刻技术，使用立体光刻3D打印机（Elegoo Mars Pro 2）与通用UV敏感树脂制备模具，然后浇注PDMS（Sylgard? 184，预聚物与固化剂比例12:1）固化成型。在IVEP方面，使用牛卵母细胞（来源为当地屠宰场卵巢），进行体外成熟、体外受精和胚胎培养至第8天，评估卵裂率和囊胚率。胚胎质量通过总细胞数（Hoechst染色）、凋亡率（Caspase-3/7试剂）和活性氧（ROS）水平（CellROX试剂）检测。清洗方案包括在添加抗生素和抗真菌药的PBS中4°C孵育48小时，随后在IVC培养基中38.5°C孵育48小时，不使用超声处理。
**研究结果**
- **实验1：连续洗涤**
研究人员将PDMS器件用含抗生素和抗真菌药的PBS冲洗30分钟，然后用IVC培养基灌注过夜，收集第一次洗涤液和第二次洗涤液（静态孵育24小时）用于胚胎培养。结果显示，使用这些条件培养基的胚胎卵裂率、囊胚率及总细胞数均显著低于对照组，表明简单的连续洗涤无法有效去除毒性物质，不能支持胚胎发育。
- **实验2：超声处理**
研究人员将PDMS器件在含抗生素和抗真菌药的PBS中4°C孵育48小时，部分器件再进行超声处理（70%乙醇及蒸馏水，45 kHz，30°C各15分钟），然后灌注IVC培养基过夜，收集条件培养基培养胚胎。结果显示，超声处理组的卵裂率和囊胚率显著低于非超声组和对照组，虽然超声组囊胚细胞数较高且ROS水平较低，但这是由于囊胚率极低造成的选择偏差。非超声组（即仅PBS孵育48小时）的条件培养基使胚胎发育率与对照组相当，提示该步骤初步有效。
- **实验3：PDMS片直接接触培养**
研究人员将PDMS片（来自3D打印模具或来自平皿对照）经与非超声组相同的清洗程序（PBS孵育48小时，IVC培养基静态孵育48小时）后，置于四孔板中与胚胎共培养（第1-5天）。结果显示，PDMS-Mould组的卵裂率、囊胚率、总细胞数、凋亡率和ROS水平均与对照组及PDMS-Ctrl组无显著差异，证明该清洗方案使PDMS器件具备生物相容性，支持IVEP以标准速率进行。
**讨论与结论**
讨论部分指出，现有研究对PDMS器件清洗的孵育时间差异很大（1小时至24小时），且体细胞比配子和胚胎对毒性更耐受，因此短时间清洗不足以支持胚胎发育。本研究中，延长PBS孵育（48小时）可能有助于去除PDMS表面可浸出化合物，但具体毒性成分未鉴定，未来需通过质谱分析验证。结论部分翻译如下：
**结论**：本研究建立了一种有效的清洗方案，用于由3D打印树脂模具制备的PDMS微流控器件，使其能够在未来的牛IVEP过程中安全应用。将PDMS器件成功整合到胚胎培养系统中，是实现动态体外培养平台（包括模拟牛生殖道体内环境的器官芯片应用）的必要步骤。需要注意的是，本研究中胚胎并未直接在器件内培养，而是通过条件培养基和PDMS基底接触作为替代评估生物相容性。在微流控通道内直接培养胚胎是下一步验证该方案在动态流动条件下适用性的合理方向。
