M2巨噬细胞外体中的SBF2-AS1通过miR-650/MDM2/NEK7轴抑制NLRP3介导的焦亡反应，从而减轻高血糖引起的足细胞损伤

《Cellular Signalling》：M2 macrophage exosomal SBF2-AS1 suppresses NLRP3-mediated pyroptosis to ameliorate high glucose-induced podocyte injury through the miR-650/MDM2/NEK7 axis

　　摘要
背景：探讨M2巨噬细胞来源的外泌体（M2-Exo）对高糖诱导的足细胞损伤的保护作用及其潜在分子机制。
方法：使用PMA联合IL-4/IL-13诱导THP-1细胞分化为M2巨噬细胞，并提取及鉴定外泌体。在体外建立高糖诱导的足细胞损伤模型，同时在体内构建链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病小鼠模型，以评估M2-Exo的保护作用及机制。
结果：成功分离并鉴定了M2-Exo。M2-Exo干预可恢复足细胞活力，抑制细胞凋亡，并减少NLRP3介导的焦亡反应。SBF2-AS1在M2-Exo中高表达，它通过竞争性结合miR-650发挥内源竞争性RNA的作用，进而上调小鼠双分钟2蛋白（MDM2）的表达。作为E3泛素连接酶的MDM2可促进NIMA相关激酶7的泛素化及降解，从而抑制NOD样受体家族吡啉结构域3介导的焦亡通路激活。体内实验表明，过表达SBF2-AS1的M2-Exo可改善糖尿病肾病小鼠的肾功能，减轻肾脏病理损伤。
结论：M2-Exo通过输送SBF2-AS1调节miR-650/MDM2/NEK7轴，抑制NLRP3介导的足细胞焦亡，进而延缓糖尿病肾病的进展。

引言
糖尿病肾病是糖尿病最严重的微血管并发症之一，是全球终末期肾病的主要病因[1][2]。随着全球肥胖率和久坐生活方式的增加，糖尿病肾病的发病率持续上升，目前约有20%的糖尿病患者受其影响[3]。从生命周期角度看，2型糖尿病和1型糖尿病患者的糖尿病肾病累积风险分别高达40%和30%[4]。糖尿病肾病以白蛋白尿为临床特征，通常呈不可逆的进行性发展，从微量白蛋白尿逐渐发展为显性蛋白尿[5]，给公共卫生系统带来巨大负担。

近年来，越来越多的证据表明足细胞损伤是糖尿病肾病发生和发展的重要决定因素[6][7][8]。作为肾小球滤过屏障的关键组成部分，足细胞的再生能力极为有限。足细胞损伤是导致蛋白尿性肾病乃至肾功能衰竭的重要环节[9]。值得注意的是，足细胞表达多种与先天性和适应性免疫相关的分子，使其能够主动参与局部炎症反应的调控[10]。最新研究指出，肾脏炎症微环境的失衡，尤其是NLRP3炎性小体介导的焦亡反应，是驱动足细胞损伤的关键机制[11][12][13]。焦亡是一种溶酶体形式的程序性细胞死亡，其特征是释放大量促炎细胞因子，如IL-1β和IL-18，进一步加剧炎症反应[14][15]。NEK7作为NLRP3炎性小体激活的关键上游调节因子，可直接与NLRP3相互作用，促进其组装和活化，最终引发焦亡[16][17]。因此，针对NEK7介导的炎性小体活化可能是抑制足细胞焦亡、延缓糖尿病肾病进展的策略，但目前尚缺乏有效的调控方法。

在肾脏微环境中，巨噬细胞通过不同的极化状态发挥重要的调控作用。M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，会加重糖尿病肾病的进展，而M2型巨噬细胞则通过释放抗炎细胞因子发挥保护肾脏的作用[18]。已有研究表明，M2巨噬细胞来源的外泌体可通过输送功能性微小RNA，如miR-25-3p，减轻高糖诱导的足细胞损伤[19]。除微小RNA外，长链非编码RNA也在多种肾脏疾病中发挥重要调控作用。其中，SBF2-AS1是一种位于11p15.1染色体上的新型长链非编码RNA，全长为2708个核苷酸[20]，它在多种恶性肿瘤中过度表达，且其过度表达与不良预后密切相关[21][22]。从机制上讲，SBF2-AS1主要作为内源竞争性RNA，充当微小RNA海绵，通过吸附多种微小RNA来调控下游靶基因的表达[23]。例如，Hang等人发现，由M2巨噬细胞来源的外泌体转运的SBF2-AS1可通过吸附miR-122-5p，以竞争性内源RNA机制限制XIAP的表达，从而影响胰腺癌的进展[24]。另一项研究则表明，SBF2-AS1可通过miR-196b-5p/RIPK2轴调节沙眼衣原体感染中的焦亡反应[25]。此外，近期研究还发现，另一种由M2-Exo输送的长链非编码RNAAFAP1-AS1可通过EZH2介导的表观遗传修饰抑制足细胞焦亡[26]。我们的初步实验也证实，SBF2-AS1在M2-Exo中显著富集，且这些外泌体能有效减轻高糖诱导的足细胞损伤。基于上述证据，我们推测M2-Exo可能通过输送SBF2-AS1来调节与足细胞焦亡相关的通路，从而在糖尿病肾病中发挥保护作用，本研究旨在深入探讨这一假设。

小鼠双分钟2蛋白（MDM2）是一种E3泛素连接酶，可调控细胞周期进展和炎症反应，在足细胞中大量表达[27]。足细胞中MDM2的缺失会加重肾小球硬化和尿白蛋白排泄，而MDM2水平的降低可能在加剧糖尿病肾小球和肾小管疾病中起关键作用[28]。已有研究表明，高糖可通过激活PHLPP1抑制Akt活性，进而减少MDM2对FoxO1的泛素化及降解，导致FoxO1在细胞核中积累并引发细胞凋亡[29]。鉴于MDM2在维持足细胞稳态中的核心保护作用，识别其新的调控底物具有重要意义。NEK7是参与NLRP3炎性小体激活的关键上游激酶，已被证明可驱动足细胞焦亡。最新研究进一步发现，高糖可通过己糖胺生物合成途径增强NEK7的O-甘露糖基化，从而使NEK7蛋白稳定并激活NLRP3炎性小体，最终引发足细胞焦亡并促进糖尿病肾病的进展[30]。这些发现表明，调控NEK7蛋白稳定性是糖尿病肾病相关足细胞损伤的关键环节。不过，除了糖基化之外，NEK7是否还经历其他翻译后修饰，尤其是MDM2介导的泛素化，目前尚不清楚。

值得注意的是，生物信息学分析提供了潜在的上游调控线索：SBF2-AS1序列与MDM2 mRNA的3′-非翻译区可能存在共同的miR-650结合位点。基于我们初步发现的SBF2-AS1在M2-Exo中高表达，且这些外泌体可减轻足细胞损伤，我们提出以下假设：M2-Exo输送SBF2-AS1，后者作为竞争性内源RNA吸附miR-650，从而解除对MDM2 mRNA的抑制，上调MDM2的表达。随后，MDM2会对其新发现的底物NEK7进行泛素化，进而抑制NEK7介导的NLRP3炎性小体激活及足细胞焦亡。

为验证这一假设，我们首先将建立高糖诱导的足细胞损伤体外模型，以评估M2-Exo及其携带的SBF2-AS1对足细胞焦亡的抑制作用。随后，利用双荧光素酶报告基因检测、RNA pull-down、Co-IP及泛素化检测等分子生物学技术，阐明SBF2-AS1/miR-650/MDM2/NEK7信号通路的调控机制。最后，通过糖尿病肾病小鼠模型进行体内功能验证。本研究有望揭示M2-Exo调控糖尿病肾病中足细胞焦亡的新机制，为该疾病的治疗提供新的生物标志物和靶点。

动物模型与分组
40只4周龄雄性C57BL/6 J小鼠（Spefer品系）经过一周的适应训练后，随机分为4组（每组n=10）：对照组、糖尿病肾病组、添加载体对照的M2-Exo组以及添加SBF2-AS1过表达载体的M2-Exo组。除对照组外，所有小鼠均喂食高脂饮食4周，随后连续3天腹腔注射链脲佐菌素（浓度为75 mg/kg，溶于pH 4.5的柠檬酸钠缓冲液中），以诱发糖尿病肾病。模型成功的标准为非禁食状态下血糖值≥16.7 mmol/L，且24小时尿白蛋白水平升高。

M2巨噬细胞的诱导分化及其外泌体的鉴定
为建立M2-Exo的体外模型，使用PMA（100 ng/mL）联合IL-4和IL-13（各20 ng/mL）诱导THP-1细胞分化为M2巨噬细胞。流式细胞术分析（图1A）显示，IL-4+IL-13诱导组中CD206+/CD68+双阳性细胞的比例明显高于对照组（11.01% vs. 0.73%），表明M2巨噬细胞已成功分化。随后从培养液中分离出外泌体。

讨论
最近的研究强调了巨噬细胞来源的外泌体在细胞间通讯中的关键作用。巨噬细胞可通过产生外泌体直接或间接与肾脏固有细胞相互作用，从而介导肾脏炎症或纤维化。例如，脐带间充质干细胞来源的外泌体可通过重塑巨噬细胞极化平衡来缓解糖尿病肾病[32]，也可通过增强M2巨噬细胞极化来改善糖尿病肾病状况。

作者贡献声明
张燕：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、研究实施、数据分析、数据整理、概念构思。詹青：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、研究实施、数据分析、数据整理、概念构思。赵明阳：写作——审稿与编辑、软件应用、方法设计、资金获取、概念构思。刘慧云：写作——审稿与编辑、实验验证、软件应用、方法设计。黄海华：写作——审稿与编辑、研究指导。

发表同意书
本研究使用的数据此前未曾发表过。

伦理审批
所有动物实验均按照ARRIVE指南2.0的要求进行，实验方案已获得南昌大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准（编号：CDYFY-IACUC-202303QR019）。

资金支持
本研究得到了中国国际医学交流基金会（项目编号：(Z-2017-26-2302)-1210564002）、江西省自然科学基金项目（项目编号：20224BAB206044）以及江西省教育厅科技研究项目（项目编号：GJJ2200134）的支持。

利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本论文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢
我们感谢所有为这项研究提供宝贵支持与帮助的人士。

张燕|詹青|赵明阳|刘慧云|黄海华
中国江西南昌市南昌大学江西医学院第一附属医院内分泌与代谢科，邮编330000