乌头碱通过抑制炎性小体介导的细胞焦亡及病理性炎症，促进受损外周神经的恢复

《Experimental Cell Research》：Aconitine promotes injured peripheral nerve recovery through restraining the activation of inflammasome-mediated cell pyroptosis and pathological inflammation

　　

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  乌头碱具有神经保护作用，能够促进周围神经损伤的修复。
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  乌头碱可诱导M2型巨噬细胞极化，从而减轻神经创伤后的神经炎症反应。
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  乌头碱能够减弱周围神经损伤后由NLRP3炎性小体介导的焦亡反应。
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  乌头碱的神经保护及抗神经炎症作用可能是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路和STING/IRF3通路实现的。

引言

周围神经损伤是一种常见的神经系统疾病，据估计在创伤患者中的发病率为2.8%[1]。当周围神经纤维因意外事故、医源性损伤或暴力而受损时，受损部位会出现轴突变性、髓鞘脱失以及神经元死亡，从而导致感觉和运动功能部分或完全丧失，影响患者的生活质量[2,3]。目前，已有多种用于治疗周围神经损伤的药物被应用于促进轴突再生和神经突生长，但这些药物的效果仍不理想，尤其是对于神经缺损长度较长的情况（≥3厘米）[4,5]。由于需要长期使用多种治疗方法来促进神经损伤恢复，因此治疗成本很高，给医疗系统和患者带来了沉重的经济负担[6]。因此，在转化神经科学领域，亟需找到一种能够实现周围神经损伤功能与结构完全再生的治疗药物。

乌头碱是一种脂质二萜类生物碱，是乌头属植物如附子、草乌、川乌等所含的主要活性成分[7]。作为传统中药，乌头碱已被证实具有多种药理作用，包括抗炎、镇痛和免疫调节作用[8]，这些特性使其成为治疗癌症、风湿热、心力衰竭和关节疼痛等疾病的潜在候选药物[9,10]。尽管乌头碱对上述疾病具有广泛的潜在治疗作用，但由于其容易引发心脏毒性和神经毒性（毒性阈值为0.2毫克/千克，而灵长类动物的致死剂量为2-5毫克/千克）[11,12]，因此在临床应用时必须严格控制剂量。目前的机制研究表明，乌头碱引起的神经毒性是通过钙平衡失调、细胞器超微结构损伤以及线粒体能量代谢崩溃来实现的，还有新证据表明PI3K/AKT信号通路和AMPK依赖的代谢监控通路的失调也与该毒性作用有关[11,13]。然而，关于乌头碱是否具有神经保护作用，尤其是在周围神经损伤修复方面的作用，目前的研究还很少，其具体作用机制也缺乏系统深入的研究。

NOD样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体是目前研究最为广泛的胞质多蛋白复合物，它由传感器NLRP3、胱天蛋白酶募集域ASC以及前体胱天蛋白酶-1组成[14]。当检测到外源性病原体配体或内源性危险信号时，NLRP3炎性小体会启动ASC的组装，进而促使胱天蛋白酶-1从其前体形式自我切割，转化为具有生物活性的活化形式cl-胱天蛋白酶-1[15]。这种蛋白酶会催化白细胞介素-1β和白细胞介素-18的前体物质转化为具有生物活性的形式，从而引发炎症反应[16]。同时，cl-胱天蛋白酶-1还会切割气道死亡蛋白D，使其发生聚合并插入细胞膜，形成超分子孔道，破坏渗透平衡，进而引发焦亡——这是一种以细胞肿胀、细胞膜破裂以及大量促炎细胞因子释放为特征的溶解性炎症性细胞死亡方式[17]。越来越多的证据表明，NLRP3炎性小体的激活动态对神经创伤的发病机制起着关键调控作用，尤其与周围神经损伤的病理过程密切相关[18]。周围神经损伤会引发NLRP3炎性小体激活，进而导致施万细胞发生焦亡以及坐骨神经髓鞘脱失[19]。NLRP3基因敲除的小鼠则表现出更强的轴突再生能力，坐骨神经功能指数更高，而且与炎性小体相关的因子如NLRP3、ASC和cl-胱天蛋白酶-1的水平也更低[20]。不过，乌头碱所介导的神经修复作用与NLRP3炎性小体信号传导之间的相互作用机制仍有待进一步阐明。

干扰素基因刺激因子（STING）是一种驻留在内质网上的跨膜蛋白，是先天免疫系统的重要调控因子[21]。最近的研究发现，STING信号传导所引发的NLRP3炎性小体激活与多种炎症性和自身免疫性疾病的发展密切相关，比如急性肾损伤[22]、绝经后骨质疏松症[23]、系统性红斑狼疮[24]等。在败血症引起的心肌病中，STING通过与干扰素调节转录因子3（IRF3）相互作用，激活NLRP3炎性小体，进而引发心肌细胞的焦亡[25]。值得注意的是，神经创伤时也会激活STING-IRF3信号通路，有研究显示，敲除STING和/或IRF3基因可以逆转神经元的凋亡、减轻炎症和神经性疼痛，并改善认知功能[26,27]。这一功能逆转现象表明，通过干预STING-IRF3信号通路来减弱NLRP3炎性小体介导的焦亡反应，可能对促进周围神经再生具有重要意义。

周围神经损伤会引发一系列复杂的炎症反应，这些反应在神经修复和疾病进展过程中起着双重作用。适度的神经炎症反应有助于清除损伤碎片并启动修复过程，而过度或长期的神经炎症反应则会引发继发性神经元损伤、纤维化及瘢痕形成，从而阻碍神经再生和功能恢复[28]。最新的研究结果表明，周围神经损伤后的神经炎症程度和持续时间主要受损伤部位巨噬细胞的作用调控[29,30]。在周围神经系统中，巨噬细胞可分为促炎性的M1亚型和抗炎性的M2亚型，M1型巨噬细胞会通过分泌肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6等物质加剧神经毒性，进一步加重组织损伤[31]。相反，M2型巨噬细胞则会通过释放IL-4、IL-10和转化生长因子-β等抗炎物质来缓解神经炎症，从而促进神经再生[32]。虽然将巨噬细胞的极化从M1型转变为M2型通常被认为有利于周围神经损伤的恢复，但在机体自身的神经修复过程中，这种转变的效率并不理想[33,34]。我们之前的研究已经证明，通过药物阻断Toll样受体4/TLR4、髓样分化因子88/MyD88和核因子-κB/NF-κB信号通路，可以诱导巨噬细胞向M2型极化，从而有效减轻神经创伤后的神经炎症反应[35,36]。不过，目前还不清楚乌头碱是否能够在周围神经损伤后，通过调节TLR4/MyD88/NF-κB通路，将M1型巨噬细胞转变为M2型，从而显著促进神经再生。

本研究有两个主要目标：一是探讨乌头碱在周围神经损伤修复中的神经保护作用，二是阐明其发挥治疗作用的分子机制，重点研究NLRP3炎性小体介导的焦亡反应以及巨噬细胞极化调控的神经炎症级联反应。我们的实验数据表明，这些作用机制可能是通过抑制STING/IRF3通路和TLR4/MyD88/NF-κB通路来实现的，这体现了乌头碱在抑制焦亡性神经元死亡和消退炎症方面的双重调控作用。这些研究旨在将机制理解与治疗潜力相结合，为基于乌头碱的周围神经损伤治疗策略提供理论和实践依据。

章节摘要

细胞培养

本研究所使用的RAW264.7巨噬细胞（商品编号91062702）和大鼠施万细胞（RSC96，商品编号CL-0199）均购自中国科学院细胞库（中国上海）。RAW264.7巨噬细胞在37摄氏度、含5%二氧化碳的潮湿环境中，于添加了10%热灭活胎牛血清和1%青霉素链霉素的RPMI-1640培养基中培养（ThermoFisher公司产品，相应编号分别为11875093和A5670701）。RSC96施万细胞则

乌头碱对坐骨神经挤压伤后神经再生与功能恢复的调控作用

后足运动功能的恢复情况是通过功能指数SFI来衡量的，其中0表示功能正常，-100表示功能完全丧失。四个神经损伤组由于功能部分恢复，其SFI值呈时间依赖性上升趋势。在手术前（0天），五个组的功能都处于正常水平，而四个神经损伤组的SFI值则显著下降，降至比对照组更低的水平（见图1A，***P<0.001）

讨论

乌头碱是一种C19二酯类二萜生物碱，过量使用时会导致严重的心脏毒性和神经毒性反应[46]。药理学研究显示，乌头碱的治疗窗口很窄，0.2毫克即可引发毒性反应，而在成人中的致死剂量则为2-4毫克[47]。尽管乌头碱毒性很强，但它及其类似物也具有一定的生物活性。近十年来，许多研究都表明乌头碱具有多种生物学活性

结论

总之，本研究表明，在适宜剂量下，乌头碱能够抑制过度的神经炎症反应，促进受损周围神经的功能恢复与再生，同时还能增强细胞的增殖和迁移能力。从机制上来看，乌头碱在周围神经损伤中发挥神经保护作用，是通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路，诱导巨噬细胞从M1型极化转变为M2型，同时阻断NLRP3炎性小体介导的

资金支持

本研究得到了以下资助：深港联合资助项目、深圳市科技计划项目，项目编号为SGDX20230116093645007；深圳市发展和改革委员会相关平台项目，编号为S2002Q84500835；深港科技创新合作区深圳部分的相关项目，编号为HTHZQSWS-KCCYB-2023060；浙江省自然科学基金，编号为LWQ20H170001。

作者贡献说明

李瑞：概念设计、数据整理、正式分析、资金获取、实验研究、项目管理、软件应用、结果验证、图表制作、初稿撰写。冯娟蓉：正式分析、软件应用、结果验证、图表制作、初稿撰写。文卓宇：正式分析、研究指导、结果验证、图表制作、初稿撰写。李金叶：正式分析、研究指导、结果验证、图表制作、初稿撰写。刘建全：方法设计

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。

致谢

作者们要感谢北京大学深圳研究生院化学生物学与生物技术学院化学肿瘤基因组学国家重点实验室的实验室主任兼主管李志刚教授和尹峰教授，他们为这项研究的开展提供了优质的实验平台！

Rui Li|Juerong Feng|Zhuoyu Wen|Jinye Li|Jianquan Liu|Liuxun Li|Ying Chen|Jianghong Huang|Jinping Wang|Lei Yang