在氨基酸偶联的鼠李糖脂稳定作用下，利用阳光驱动金纳米粒子的生物合成：其合成方法、胶体特性分析以及在HT-29细胞系中的细胞毒性评估

《Inorganic Chemistry Communications》：Sunlight-driven biosynthesis of gold nanoparticles stabilized by amino acid conjugated rhamnolipid: synthesis, colloidal characterization and cytotoxicity evaluation in HT-29 cell line

　　摘要：通过酸胺偶联反应合成了与L-半胱氨酸和L-组氨酸结合的鼠李糖脂衍生物，并通过ATR-FTIR、1H及13C NMR光谱进行了验证。其一级和二级临界胶束浓度分别为0.30/1.08 mM（Hist-RLs）和0.19/0.76 mM（Cyst-RLs），均低于天然鼠李糖脂的0.8/2.0 mM，表明偶联后两者的两亲性有所提升。氨基酸的结合引入了活性组氨酸和咪唑功能团，使得这些生物表面活性剂相较于天然鼠李糖脂具有更强的还原能力以及与金表面结合的能力。在临界胶束浓度以上，这两种衍生物可在中性pH条件下无需外部还原剂即可作为还原剂和稳定剂，用于太阳光驱动下的金纳米粒子合成。高分辨率透射电子显微镜检测显示，所制备的金纳米粒子呈球形，尺寸为7–9 nm，Zeta电位分别为?46 ± 0.1 mV（Cyst-RLs@AuNPs）和?57.6 ± 0.13 mV（Hist-RLs@AuNPs），该值低于天然鼠李糖脂对应的数值，有利于实现超过12个月的长期胶体稳定性。体外实验中，这类纳米粒子对HT-29结直肠腺癌细胞的IC50值分别为70 ± 2.18、60 ± 1.94和50 ± 2.68 μg/mL，显著低于同种细胞系中真菌提取物包覆金纳米粒子的IC50值（84.58 μg/mL）。AO/EtBr染色结果显示，这些纳米粒子能诱导细胞凋亡，且效果在Hist-RLs@AuNPs中最为显著。这些研究结果表明，氨基酸偶联鼠李糖脂是一种化学性质明确、可重复性强 的平台，可用于制备稳定且生物相容性良好的金纳米粒子，同时还具备优异的抗癌功效，值得进一步开展体内实验研究。

引言：贵金属纳米粒子因其高表面积与体积比、可调控的大小以及出色的电子、光学、催化和吸收性能，被广泛应用于化学、生物医学和材料科学领域[1][2][3]。其中，金纳米粒子由于其易于合成和表面功能化、较高的生物利用度、在水介质中的稳定性、抗菌活性以及对生物系统的低毒性，被广泛用作催化[4]、药物和基因递送[5]、生物成像与传感[6]、抗菌[7]、抗病毒[8]以及热疗灭瘤[9]等方面的材料[10][11]。不过，这些性能会受到封端剂和还原剂的种类以及合成方法的显著影响[12][13]。最新研究表明，纳米粒子的形态和表面化学性质对其在生物系统中的摄取、分子相互作用以及细胞毒性起着关键作用[14]。尽管已有多种化学方法用于金纳米粒子的合成，但由于存在还原剂和稳定剂的毒性问题以及未反应杂质的残留，这些方法的生物应用仍受到限制[15][16]。因此，开发一种简单、可靠且环保的合成方法，利用天然产物作为还原剂和封端剂来制备金纳米粒子，尤其对于抗菌、抗氧化和抗癌应用而言，具有重要的研究意义。

近年来，人们越来越关注利用植物、水果、细菌、藻类、真菌和酵母的提取物，以及各种生物分子作为还原剂和封端剂来绿色合成纳米粒子[17][18][19][20][21]，这类方法相比传统合成方法更具优势，因为它能避免有毒物质的使用，成本低，且对环境的影响较小[22]。例如，已有研究探讨了利用假花菜提取物绿色合成金纳米粒子，并研究了其抗氧化、抗菌和抗癌活性[23]；还有研究报道了利用植物辅助方法合成金纳米粒子，用于光催化、抗癌和抗氧化领域[24]；另有研究指出，利用橙皮提取物通过环保方式合成的金纳米粒子具有多种生物和催化功能[25]；此外，还有研究评估了利用薄荷精油绿色合成金纳米粒子和银纳米粒子及其生物学效应[26]；还有研究报道了利用粗珊瑚提取物绿色合成金纳米粒子，用于降解有毒有机污染物[27]。然而，这些方法也存在一些缺陷，如纳米粒子稳定性较低、难以纯化活性还原功能、原材料的供应受季节和地域限制、对纳米粒子形成机制的理解不足，以及难以获得尺寸均匀的纳米粒子，这些都限制了这类纳米粒子的合成及其应用[28][29]。值得注意的是，香料衍生物已被广泛用于绿色合成金纳米粒子，姜黄素及其相关多酚就具有还原和封端双重功能[30][31]，但这些提取物的组成较为复杂，不同批次之间存在差异，这给研究的重复性和机制阐明带来了挑战。为了解决这些问题，可以使用生物相容性强、化学性质明确的化合物作为封端剂和还原剂，从而合成出高度稳定且无毒的纳米粒子。

基于上述考虑，本研究采用改进的Turkevich法，利用多种氨基酸盐作为生物相容性封端分子来合成金纳米粒子[32]，并且已有研究对比分析了氨基酸驱动合成的金纳米粒子的生物相容性[33]。还有研究报道，利用2-脱氧-D-葡萄糖包覆的金纳米粒子作为一种新型材料，可提高放疗在正常细胞和癌细胞中的疗效[34]；也有研究指出，肽偶联金纳米粒子有助于改善各类癌症的诊断和治疗效果[35]。此前，我们的研究团队也曾报道过，利用胆汁酸及其氨基酸衍生物作为稳定剂和还原剂，通过绿色化学方法合成尺寸和形状可控的银纳米粒子和金纳米粒子，这些纳米粒子可应用于生物和化学领域[36][37][38]。

鼠李糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂，主要作为铜绿假单胞菌的次级代谢产物而存在[39]。由于它含有通过糖苷键连接的脂肪酸链和鼠李糖单元，因此具有两亲性，能够降低表面张力并呈现较低的临界胶束浓度。此外，鼠李糖脂还具有良好的生物降解性、较低的毒性、环境友好性，且来源于可再生资源，因此有望用于抗菌、抗癌、土壤修复和农业等领域[40][41]。除了表面活性之外，鼠李糖脂还因其能与脂质双层发生相互作用而具有抗菌和细胞毒性等内在生物活性[42]，这为其作为生物相容性封端剂用于纳米粒子合成、进而应用于生物医学领域提供了进一步依据。研究表明，基于鼠李糖脂的平台在多种纳米系统中都具有广泛应用潜力，从乳液到纳米结构载体均有涉及，充分体现了其作为多功能生物表面活性剂支架的巨大价值[43]。此外，半胱氨酸也被用作小鼠疫苗中金纳米粒子功能化的配体[44]。已有研究报道，利用多种还原剂可以合成鼠李糖脂稳定的银纳米粒子、金纳米粒子，以及CuO和ZnO纳米粒子[45][46][47][48]，这些研究证实了这两种结构单元在纳米粒子表面化学中的作用，但目前尚未有研究将它们整合为一个整体，通过直接氨基酸偶联的方式用于金纳米粒子的合成，且不添加额外的还原剂。

癌症可能发生在几乎所有的组织中，包括皮肤、器官、血液和骨骼，其产生的原因是控制细胞分裂的调控系统因基因突变而失效。癌症可能由遗传因素引发，也可能由环境因素诱发，或是细胞代谢过程中出现的异常而自发产生[49]。结直肠腺癌，也就是常说的结肠癌，是指发生在直肠、结肠或两者同时发生的恶性肿瘤，是全球范围内第三大常见癌症类型。如果在早期发现，这种癌症是完全可以预防和治疗的[50][51]。这类癌症的产生是由于肠道上皮细胞中不断积累基因突变所致。HT-29细胞系已被广泛用于研究人类癌症的生物学特性，因为这类细胞具有成熟的肠道细胞特征，如能分泌黏液的细胞或肠上皮细胞[52][53]。不过，放疗和化疗会对健康细胞造成诸多不良影响，而且结肠癌细胞往往容易对药物产生耐药性[54]。已有许多研究证明了天然鼠李糖脂的抗癌潜力，比如Rha-Rha-C10-C10对MCF-7乳腺癌细胞具有细胞毒性作用[55]，部分纯化的鼠李糖脂也对HT-29和HeLa细胞系具有抗癌效果[56]。虽然已有研究分别探讨了天然鼠李糖脂稳定的金纳米粒子以及氨基酸封端金纳米粒子的应用，但目前尚无研究通过将氨基酸直接偶联到鼠李糖脂主链上，构建出兼具还原和稳定功能的双功能模板。这种功能化设计具有独特的机制优势：半胱氨酸的巯基可以与金离子形成配位键，同时在光照条件下可作为初级电子供体；而组氨酸的咪唑环则能在阳光照射下促进金离子配位并实现内层电子转移。与依赖成分复杂的生物分子混合物的植物或微生物提取物方法相比，氨基酸偶联鼠李糖脂属于化学性质明确的平台，其胶束行为与临界胶束浓度密切相关，更具重复性和可预测性。在本研究中，我们通过酸胺偶联反应合成了Cyst-RLs和Hist-RLs，将其作为双功能还原剂和稳定剂，用于在中性pH条件下通过太阳光驱动合成金纳米粒子，研究内容包括结构表征、胶体稳定性分析以及针对HT-29结直肠腺癌细胞的体外抗癌效果评估。

材料：鼠李糖脂R90和三乙胺购自Sigma Aldrich公司；半胱氨酸甲酯盐酸盐和组氨酸甲酯盐酸盐也购自Sigma Aldrich公司。二乙基氰膦酸酯购自TCI化学品公司，氯金酸、氢氧化钠和氯化钠购自LOBA Chemie公司，碳酸氢钠购自Pallav公司。所有试剂均直接使用，无需进一步纯化。人类HT-29结直肠腺癌细胞系则从经过认证的细胞库中获得。

氨基酸偶联鼠李糖脂的合成：首先，将1.613 mM的鼠李糖脂和3.5 mM的三乙胺溶解在10 mL的DMF中，倒入25 mL的干燥RB烧瓶中，然后在室温下以1200 rpm的速度搅拌15分钟。接着，用冰块和晶体盐将反应混合物的温度降至接近0°C。随后向反应混合物中加入1.95 mM的二乙基氰膦酸酯，继续搅拌10分钟。之后，再加入1.95 mM的半胱氨酸甲酯盐酸盐或组氨酸甲酯盐酸盐。

结论：本研究表明，氨基酸偶联是一种有效策略，可通过增强鼠李糖脂的还原和稳定能力，实现绿色合成结构明确的金纳米粒子。Cyst-RLs和Hist-RLs的临界胶束浓度分别为0.19/0.76 mM和0.30/0.10 mM，明显低于天然鼠李糖脂的0.8/2.0 mM，这说明偶联后两者的两亲性有所提升。在临界胶束浓度以上，这些衍生物的自组装胶束结构能够提供化学性质明确的模板，引导金纳米粒子的形成。

CRediT作者贡献说明：Z. Syed Wasim Abdin负责写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、可视化、验证、软件应用、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理以及概念构思；Aravind Baskaran负责方法设计、正式分析以及数据整理；Mythileeswari Lakshmikanthan负责写作——初稿撰写、方法设计、正式分析以及数据整理；Jayapalan Kasthuri负责正式分析；Kathiravan Krishnan负责写作——初稿撰写、方法设计以及实验研究；Nagappan Rajendiran负责写作。

利益冲突声明：作者声明不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢：作者NR教授和SWAZ先生衷心感谢Anusandhan国家研究基金会（编号EEQ/2023/001122，日期2024年1月22日）、印度政府以及泰米尔纳德邦政府提供的资金支持，相关资助编号分别为CMRG2400932，日期为2025年7月16日。

Z. Syed Wasim Abdin是印度钦奈马德拉斯大学聚合物科学系的科研学者，他的研究主要集中在基于鼠李糖脂及其衍生物的纳米粒子、纳米团簇，以及其在生物技术和食品包装领域的应用。

Z. Syed Wasim Abdin|Aravind Baskaran|Mythileeswari Lakshmikanthan|Jayapalan Kasthuri|Kathiravan Krishnan|Nagappan Rajendiran
印度泰米尔纳德邦钦奈市Guindy校区马德拉斯大学聚合物科学系，邮编600025