5-HT4受体配体RS67333通过抑制乙酰胆碱酯酶调节纹状体乙酰胆碱和多巴胺释放

《ACS Chemical Neuroscience》：5-HT4 Receptor Ligand RS67333 Modulates Striatal Acetylcholine and Dopamine Release via the Inhibition of Acetylcholinesterase

　　

血清素5-HT4受体（5-HT4Rs）通过调节塑造情绪、认知和运动功能的神经环路，已成为神经精神疾病和神经退行性疾病的潜在治疗靶点。5-HT4Rs的配体可以改变多巴胺（DA）和乙酰胆碱（ACh）的传递，但其机制和环路尚未完全明确。已有研究表明，一些5-HT4R激动剂可能具有抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的作用，这引发了研究人员关于5-HT4R配体可能通过此途径调节ACh和DA的推测。在本研究中，研究人员分别使用快速扫描循环伏安法（FCV）和基因编码的ACh传感器GRABACh3.0，离体检测了小鼠脑片中部分5-HT4R激动剂RS67333对纹状体DA和ACh释放动力学的影响。研究人员发现，RS67333显著调节了背外侧纹状体（DLS）和伏隔核核心区电诱发的DA释放，而这种效应被烟碱受体（nAChR）拮抗剂所消除。同时，RS67333通过延长细胞外ACh寿命来改变诱发的ACh信号，并且相应地，研究人员发现RS67333抑制了纹状体AChE酶活性。相比之下，另一种不抑制纹状体AChE的5-HT4R配体BIMU8对诱发的纹状体ACh或DA释放没有影响。这些发现表明，RS67333通过AChE抑制而非5-HT4Rs来调节纹状体ACh传递，进而通过nAChR影响DA释放的下游调控。这些发现强调了在将功能归因于5-HT4Rs时需要谨慎，同时也凸显了一些所谓的5-HT4R配体作为AChE抑制剂可能具有治疗ACh/DA相关疾病的潜在药理特性。

**研究背景与问题**
血清素5-HT4受体（5-HT4Rs）是Gs/Golf偶联受体，在海马和基底节等脑区表达，调节情绪、认知和运动功能。5-HT4R配体（如部分激动剂RS67333）在动物模型中表现出增强记忆、改善应激相关行为以及减轻帕金森病（PD）模型中左旋多巴诱导的异动症等作用。这些配体被认为通过调节多巴胺（DA）和乙酰胆碱（ACh）传递来发挥作用，但具体机制和环路尚未完全阐明。已有研究表明某些5-HT4R激动剂（如Renzapride和(S)-zacopride）可增加大鼠纹状体细胞外DA水平，但中脑DA神经元中缺乏5-HT4R基因表达的证据，提示其调节DA的作用可能通过中间环路间接实现。在纹状体中，5-HT4Rs定位在胆碱能中间神经元（ChIs）和表达D2受体的GABA能投射神经元上，而ACh和GABA分别通过DA轴突上的烟碱受体（nAChRs）和GABAA/B受体强烈调节DA释放。此外，部分5-HT4R配体（如RS67333）具有多靶点特性，包括抑制乙酰胆碱酯酶（AChE）的能力，其结构与AChE抑制剂多奈哌齐相似，并在体外检测中显示出亚微摩尔级别的AChE抑制活性。然而，这种AChE抑制在生理脑环境中的影响尚未得到证实。因此，本研究旨在探究RS67333对纹状体DA和ACh释放动力学的影响，并明确其潜在机制。
**研究内容与结论**
研究人员通过离体小鼠脑片实验，利用快速扫描循环伏安法（FCV）和基因编码的ACh传感器GRABACh3.0，检测了RS67333对纹状体DA和ACh释放的影响，并与另一种5-HT4R配体BIMU8进行比较。研究发现，RS67333通过抑制纹状体AChE延长细胞外ACh信号，进而通过nAChR调节DA释放，而这一作用与5-HT4R无关。BIMU8（不抑制AChE的5-HT4R配体）对ACh或DA释放无显著影响。该研究强调，对5-HT4R配体作用的归因需谨慎，同时揭示了此类化合物作为AChE抑制剂的潜在治疗价值。论文发表在《ACS Chemical Neuroscience》。
**主要关键技术方法**
1. 快速扫描循环伏安法（FCV）：使用碳纤维微电极（CFM）检测电刺激诱发的纹状体细胞外DA浓度（[DA]o），记录单脉冲（1p）和5脉冲（5p/100 Hz）刺激下的DA释放。
2. 基因编码荧光传感器成像：通过颅内注射腺相关病毒（AAV）在小鼠纹状体表达GRABACh3.0（ACh传感器）或GRABDA3h（DA传感器），利用荧光显微镜成像检测诱发的ACh或DA信号。
3. 乙酰胆碱酯酶（AChE）活性测定：收集纹状体组织打孔样本，使用商品化比色法试剂盒（基于DTNB检测硫代胆碱）测定AChE活性，并通过Michaelis-Menten拟合分析酶动力学参数。
样本来源：雄性及雌性C57BL/6J小鼠（8–18周龄，Charles River），离体脑片制备于冰冷却切割液中，记录于人工脑脊液（aCSF）中。
**研究结果**
**DA Release in DLS and NAcC Is Inhibited by 5-HT4R Agonist RS67333**
通过FCV实验，研究人员发现RS67333（10 μM）显著降低背外侧纹状体（DLS）和伏隔核核心区（NAcC）中单脉冲（1p）诱发的[DA]o峰值，并增加5p:1p比值（反映短时程可塑性变化）。利用GRABDA3h传感器成像进一步验证了RS67333降低DA释放概率并缓解短时程抑制（STD）的效应。
**Modulation of DA Release by RS67333 Is Mediated by Cholinergic Interneurons in DLS and NAcC**
在竞争性nAChR拮抗剂DHβE存在下，RS67333对DLS和NAcC中诱发的[DA]o及5p:1p比值均无显著影响，表明RS67333对DA释放的调节依赖于ACh通过nAChR的作用。
**RS67333 Modifies ACh Signals in DLS and NAcC as an AChE Inhibitor**
通过GRABACh3.0成像，RS67333未显著改变诱发的ACh信号峰值，但显著延长了细胞外ACh信号的半衰期并增加了曲线下面积（AUC）。进一步使用AChE化学发光法检测，发现RS67333（1 μM和10 μM）浓度依赖性地抑制纹状体AChE活性，其抑制程度与强效AChE抑制剂安贝氯铵相当。
**Alternate 5-HT4R Ligand BIMU8 Does Not Inhibit AChE, or Alter Striatal ACh or DA Release**
BIMU8（1 μM）不抑制纹状体AChE活性，对诱发的ACh信号（峰值、AUC、半衰期）和DA释放（1p和5p刺激下的[DA]o及5p:1p比值）均无显著影响，表明单纯激活5-HT4R不足以调节ACh或DA传递。
**总结与讨论**
讨论部分指出，RS67333通过抑制AChE延长细胞外ACh寿命，导致nAChR脱敏，进而调节DA释放。这一机制与5-HT4R无关，因为BIMU8（缺乏AChE抑制活性）未产生类似效应。研究结果强调了在评估5-HT4R配体功能时需考虑其潜在的AChE抑制活性，同时也提示此类化合物的“脱靶效应”可能为治疗神经退行性和神经精神疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和抑郁症）中胆碱能和多巴胺能功能障碍提供新的治疗机会。
**研究结论翻译**
综上所述，研究人员的研究揭示了RS67333作为纹状体AChE抑制剂的显著功能，它调节纹状体ACh信号，并对DA释放产生下游影响。相比之下，纹状体5-HT4Rs在调节纹状体ACh或DA信号中的作用似乎很小。应继续关注其他类似声称的5-HT4R配体对ACh信号的潜在影响，以防止未来将药物效应错误归因于5-HT4Rs，并更全面地理解此类化合物的潜在用途。它们的治疗效用不必受限；相反，其“脱靶效应”可能在涉及胆碱能和多巴胺能功能障碍的神经退行性和神经精神疾病中提供治疗机会。