《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects》：Mitochondria-Targeted Ruthenium Nanozyme as ROS Scavenger and NAD+-Booster to Alleviate Mitochondria Dysfunction in Alzheimer’s Disease
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摘要通过减轻氧化应激来调节线粒体功能障碍，近来被视为治疗阿尔茨海默病的一种有前景的策略，但这一方法忽略了功能异常的线粒体会产生活性氧这一事实。在此，我们设计了一种针对线粒体的钌纳米酶Ru@CP5-TPP，它能够同时清除活性氧并消除受损线粒体，从而提升线粒体功能。该纳米酶是通过用阳
摘要
通过减轻氧化应激来调节线粒体功能障碍，近来被视为治疗阿尔茨海默病的一种有前景的策略，但这一方法忽略了功能异常的线粒体会产生活性氧这一事实。在此，我们设计了一种针对线粒体的钌纳米酶Ru@CP5-TPP，它能够同时清除活性氧并消除受损线粒体，从而提升线粒体功能。该纳米酶是通过用阳离子柱[5]芳烃（CP5）修饰超小钌纳米颗粒，再通过主客体识别作用结合上靶向线粒体的三苯基膦（TPP）而制备而成的。在近红外I激光照射下，Ru@CP5-TPP能够穿透血脑屏障，靶向小胶质细胞的线粒体，并凭借其类似CAT和SOD的活性清除现有的活性氧。此外，它还能模拟NADH氧化酶的功能，催化NADH转化为NAD+，进而引发线粒体自噬，最终阻止活性氧的再生。实验结果表明，Ru@CP5-TPP能有效缓解线粒体功能障碍，抑制Aβ沉积，减轻神经炎症，并改善阿尔茨海默病小鼠模型中的记忆缺陷。这项研究为利用纳米酶的多酶活性实现阿尔茨海默病的多靶点治疗提供了新途径。
引言
纵向研究显示，线粒体功能障碍先于淀粉样β蛋白积累和tau蛋白异常出现，因此被认定为阿尔茨海默病发病机制中的核心因素[1]、[2]。由受损线粒体引发的诸多相互关联的因素，包括氧化应激、钙平衡紊乱、代谢失调以及线粒体自噬功能受损等，都会导致神经元早期死亡并引发阿尔茨海默病症状[3]、[4]、[5]。在这些因素中，过度活跃的活性氧所导致的氧化应激在推动Aβ蛋白异常、tau蛋白异常以及神经炎症方面起着关键作用[6]、[7]、[8]。因此，减轻线粒体中的过量活性氧是缓解线粒体损伤、延缓阿尔茨海默病进展的一种有效策略。在各种消除线粒体活性氧的策略中，纳米酶因其具备多种酶活性、稳定性高、成本低且设计灵活等优点，受到了广泛关注[9]、[10]、[11]、[12]。例如，经过TPP修饰的纳米材料，如聚氧金属酸盐-铈复合材料和二硫化钼量子点，已被用于清除阿尔茨海默病小鼠模型中的线粒体活性氧并治疗慢性炎症[13]、[14]、[15]。与CeO2纳米颗粒类似，钌纳米颗粒也具有强大的活性氧清除能力以及出色的生物相容性[16]、[17]、[18]。更为重要的是，它们具备内在的光热转换特性，有助于穿透血脑屏障并在脑组织中积累，这为其在生物医学领域的应用带来了巨大潜力[19]、[20]。
尽管纳米酶在清除活性氧方面表现优异，但它们无法从根本上阻止活性氧的再次生成。一旦纳米酶从细胞中被清除，那些持续受损的线粒体又会继续产生新的活性氧，从而导致细胞持续受损[21]。因此，要想持久抑制活性氧的再生，就需要采取一种既能消除过量活性氧又能清除受损线粒体的双重策略。线粒体自噬是一种在进化过程中一直存在的、用于选择性清除受损线粒体的机制，对于维持线粒体功能平衡至关重要。然而，越来越多的证据表明，在阿尔茨海默病模型中，线粒体自噬途径会出现障碍，而这往往伴随着NAD+水平的下降[22]、[23]、[24]、[25]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）作为代谢调控中的重要辅酶，在调节线粒体自噬方面发挥着关键作用。由于NAD+是SIRT1-SIRT7、CD38、SARM1和PARPs等酶的必需辅酶，它可通过参与多种信号通路来促进线粒体自噬[24]、[26]、[27]。因此，提高细胞内的NAD+水平是一种可行的策略，可通过激活线粒体自噬来缓解线粒体功能障碍。传统的NAD+补充方法通常依赖于摄入烟酰胺单核苷酸（NMN）或烟酰胺核糖（NR）等前体物质，这些物质可被细胞吸收后用于增强NAD+的合成[28]。然而，由于这些前体物质的生物利用度较低且可能存在潜在的不良反应，其在临床上的应用受到限制[29]。因此，直接将NADH转化为NAD+，无需额外补充前体物质，或许能为提高细胞内NAD+水平并促进线粒体自噬提供新的思路。近期有研究表明，多种纳米酶——包括掺杂金属氮的石墨烯、多金属纳米颗粒以及单原子催化剂——都具有类似NADH氧化酶的活性，能够催化NADH氧化为NAD+。这一内在特性为纳米酶促进线粒体自噬提供了另一种可能的机制[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。
在此，我们报告了一种针对线粒体的钌纳米酶Ru@CP5-TPP的合成方法。该纳米酶是通过用靶向线粒体的配体TPP修饰带有阳离子柱[5]芳烃（CP5）涂层的钌纳米颗粒（Ru@CP5）而制成的（见图1）。选择钌纳米颗粒作为核心成分，是因为它们具有多种类似酶的活性（如SOD、CAT和NOX活性），尺寸极小，同时还具备光热转换能力，这些特性共同使得它们能够清除活性氧、转化NADH，并帮助穿透血脑屏障。CP5成分既可作为钌纳米颗粒的稳定剂，也可通过超分子相互作用作为宿主分子，容纳TPP配体。正如预期的那样，Ru@CP5-TPP在近红外I激光照射下能够穿透血脑屏障，精准靶向小胶质细胞的线粒体，并依靠钌纳米颗粒的类似CAT和SOD的活性高效清除现有的活性氧。与此同时，它还能模拟NADH氧化酶的功能，催化NADH转化为NAD+。由此带来的NAD+水平上升会触发线粒体自噬，进而通过清除功能异常的线粒体来防止活性氧的再生。实验结果表明，使用Ru@CP5-TPP处理后，阿尔茨海默病APPswe/PSEN1dE9（APP/PS1）小鼠模型中的脑内Aβ蛋白负荷显著降低，神经炎症得到缓解，认知功能缺陷也有所改善。这项工作为利用针对线粒体的纳米酶协同促进活性氧清除和线粒体自噬，从而缓解阿尔茨海默病病理表现，提供了一种新的策略。
章节要点
材料与动物
RuCl?·3H?O购自昆明贵金属研究所。（3-羧基丙基）三苯基膦溴化物和NaBH?购自上海阿拉丁生化科技有限公司。NAD?/NADH检测试剂盒（含WST-8）、总超氧化物歧化酶检测试剂盒（含WST-8）、MitoTracker、线粒体膜电位检测试剂盒（含JC-1）、CCK-8试剂盒、活性氧检测试剂盒以及脂质过氧化MDA检测试剂盒均购自北京百奥莱博科技有限公司（上海）。
Ru@CP5-TPP的表征及其多酶样活性
Ru@CP5-TPP的制备过程如图1所示。首先，通过用NaBH?还原RuCl?·3H?O来制备钌纳米颗粒。透射电子显微镜观察结果显示，初步制备得到的钌纳米颗粒呈球形，平均直径约为2纳米，但分散性较差（见图1a、c）。随后，将作为稳定剂的阳离子柱[5]芳烃（CP5）修饰到钌纳米颗粒表面，这一操作显著提升了它们的溶解性。
结论
总之，我们开发出了一种治疗阿尔茨海默病的新策略，该策略通过同时清除活性氧并诱导小胶质细胞发生线粒体自噬，来缓解线粒体功能障碍。Ru@CP5-TPP具备抗氧化和类似NADH氧化酶的双重酶活性，因而能够采取双管齐下的治疗方式。这种设计通过促使受损线粒体被清除，有效防止了活性氧的再生，从而克服了传统抗氧化剂的局限性。
CRediT作者贡献说明
张春峰：方法学研究。周月兆：方法学研究。刘杰：文章撰写——审阅与编辑。刘玉佳：方法学研究。贾志：文章撰写——初稿撰写。杨永兰：方法学研究。王立强：方法学研究。
利益冲突声明
我们声明，本手稿为原创内容，未曾发表过，也未提交给其他任何期刊审核，在贵刊做出决定之前不会向其他地方投稿。我们确认，本文不存在任何利益冲突。同时，我们保证所有列出的作者都已阅读并同意本手稿的内容，此外也没有其他符合作者资格但未被列入名单的人士，而且各作者的贡献顺序也已明确。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（22277041）以及广东省基础与应用基础研究基金（2025A1515012934）的支持。
Zhi Jia|Liqiang Wang|YongLan Yang|Yuezhao Zhou|Chunfeng Zhang|Yujia Liu|Jie Liu
