《Frontiers in Neurology》：Targeting mitochondrial ribosomal proteins: a functional and translational framework for neurodegenerative disease research
线粒体功能障碍是神经退行性疾病的核心特征，然而调控线粒体蛋白质合成的分子机制尚不充分明确。线粒体核糖体蛋白（mitochondrial ribosomal proteins, MRPs）对氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）系统线粒体编码组分的翻译至关重要，正逐渐被认为是神经元稳态和存活的关键调控因子。在这篇小型综述中，研究人员审视了当前关于线粒体核糖体的知识，重点分析了三种线粒体核糖体蛋白——MRPL44、NAM9 和 GEP3——强调了它们在维持线粒体完整性中的结构和功能作用。研究人员讨论了将这些蛋白的改变与神经退行性变相关关键致病过程（包括氧化磷酸化受损、氧化应激增加和线粒体质量控制缺陷）联系起来的证据。重要的是，研究人员提出了一种整合性研究视角，将这些 MRPs 定位为神经退行性疾病中组织特异性易感性的潜在调控因子。通过综合现有数据并识别关键知识空白，研究人员概述了旨在阐明它们对神经元功能障碍和疾病进展的贡献的未来方向。这项工作强调了线粒体核糖体蛋白作为神经退行性病理学中尚未充分探索的决定因素，并表明对其系统性的研究可能揭示新的机制见解和治疗机会。
1 引言
线粒体疾病是一组以线粒体功能受损为特征的遗传异质性疾病。线粒体是普遍存在的细胞内细胞器，仅在成熟红细胞中缺失，并作为中间代谢的中心枢纽。它们关键参与多种代谢途径，包括氧化磷酸化（OXPHOS）、脂肪酸β-氧化、三羧酸（TCA）循环、尿素循环、糖异生和酮体生成。线粒体通过ATP产生为维持生命和器官功能提供超过90%的细胞能量。线粒体功能受损导致ATP合成减少，进而引起细胞功能障碍、损伤，并可能引发细胞死亡。当这一过程系统性发生时，可能导致进行性多器官功能障碍。高能量需求组织，如心脏、大脑、骨骼肌和肺，对线粒体功能障碍尤为易感。
线粒体疾病临床异质性高，且由于其高度可变的表现，诊断常具挑战性。临床表现可能包括癫痫发作、卒中样发作、严重发育迟缓、行走障碍、视觉和言语缺陷、胃肠动力障碍以及一系列其他系统性并发症。涉及三个或以上器官系统应怀疑潜在的线粒体疾病。尽管线粒体疾病传统上被视为儿科疾病，但成人发病形式正日益被认识。
线粒体生物发生依赖于两个物理和功能上不同的基因组的协调表达：核DNA（nDNA）和线粒体DNA（mtDNA）。虽然估计约3,000个核基因对线粒体结构和功能有贡献，但人类mtDNA仅编码37个基因。这些包括氧化磷酸化（OXPHOS）系统的13个多肽和线粒体内翻译所需的24个RNA（2个rRNA和22个tRNA）。所有其余线粒体蛋白均为核编码、在胞质中合成并输入到细胞器中。除ATP产生外，线粒体是细胞代谢的中心枢纽，参与生物合成和分解代谢途径、氧化还原平衡和核苷酸合成。它们的功能特化在不同发育阶段和分化组织中各异，强调了其在细胞稳态中的关键作用。
线粒体疾病由mtDNA或nDNA的遗传性或新生突变导致，引起线粒体蛋白或RNA分子缺陷。尽管线粒体功能普遍存在，但临床表现常具有组织特异性，可能反映了仍不充分理解的发育和调控因素。即使考虑组织特异性亚型，不同综合征中器官受累的显著变异也难以解释。由于线粒体在不同组织中执行多样化功能，线粒体疾病构成了一组高度异质性的疾病。其临床表现常多变，可能使早期诊断复杂化。这些疾病的一个定义性特征是表型异质性：相同的mtDNA突变可能产生不同的临床表型，而不同的mtDNA或nDNA突变可能导致相似的综合征，如Leigh综合征，其与大约12个不同基因的突变相关。
线粒体疾病包括由影响氧化磷酸化（OXPHOS）复合体组装和/或功能的遗传缺陷、线粒体底物或离子转运受损、或线粒体生物发生改变引起的一组异质性疾病。这些缺陷减少ATP产生并导致高度可变的临床表型，通常需要仅在专门中心才能进行的分子诊断。核糖体缺陷是这些疾病的一个相关子集，涉及细胞质（80S）或线粒体（70S）核糖体。它们可能是遗传性或获得性的，通常源于核糖体蛋白单倍体不足或核糖体生物发生受损。线粒体核糖体蛋白或组装因子的突变尤其重要，因为线粒体核糖体翻译由mtDNA编码的13个必需OXPHOS亚基。一致地，几个线粒体核糖体蛋白基因与以氧化磷酸化缺陷为特征的疾病相关，包括Leigh综合征、多发性线粒体功能障碍综合征和非综合征性听力丧失。
在最近一项使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为模型生物研究人类神经退行性疾病的研究中，鉴定出三个编码线粒体核糖体蛋白的基因——MRPL44、NAM9和GEP3。这些基因的缺失或功能障碍与亚碲酸盐抗性相关，并且如该研究中所讨论的，可能对人类神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病的发病机制有所贡献。
迄今为止，支持核编码的线粒体蛋白MRPL44、NAM9和GEP3与人类阿尔茨海默病（AD）或帕金森病（PD）之间关联的直接证据仍然缺乏。MRPL44是一种保守的线粒体大核糖体亚基蛋白，具有明确的人类直系同源物。NAM9在功能上与哺乳动物线粒体小核糖体亚基蛋白相关，尽管尚未完全建立严格的一对一直系同源性。GEP3在酵母中为线粒体核糖体生物发生所需，但尚未鉴定出明确的人类直系同源物，尽管在高等真核生物中存在功能相关因子。
然而，鉴于它们在线粒体生物学中的新兴作用以及线粒体功能障碍对神经退行性变的核心贡献，这些蛋白值得进一步研究作为AD和PD发病机制的潜在贡献者。因此，本小型综述的一个关键目标是强调这一未被满足的研究领域，并促进未来旨在阐明MRPL44、NAM9和GEP3在人类神经退行性疾病中相关性的研究。
在此，研究人员提出了一项实验策略，旨在全面表征这三种蛋白的生理功能，特别强调它们在线粒体翻译中的作用以及它们在蛋白质合成之外的其他细胞过程中的潜在参与。该方法将为理解与MRPL44、NAM9和GEP3突变相关的表型提供分子框架，这些突变已在酵母中开始被表征，并将促进这些研究扩展到其他模型系统。最终，研究人员的目标是阐明影响这些蛋白的遗传缺陷如何可能促进人类和动物神经退行性疾病的发作和进展，另一方面，为开发具有治疗这些疾病潜力的药物开辟一条路径。
2 当前知识状态
将线粒体核糖体蛋白缺陷与神经元易感性联系起来的致病级联反应总结于图1。神经退行性疾病的特征是在解剖学或功能上相关的神经元系统的进行性和选择性丧失。线粒体作为细胞ATP的主要来源，对神经元功能至关重要。它们的功能障碍引起原发性线粒体疾病，并促进常见神经退行性疾病，包括阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和亨廷顿病（HD）。尽管临床和遗传上异质，这些疾病共享线粒体功能障碍作为关键致病机制。线粒体调节细胞存活和死亡，影响衰老，并与遗传性神经退行性疾病中涉及的蛋白相互作用。线粒体疾病由mtDNA和nDNA突变引起，导致母系、常染色体或X连锁遗传模式。传统上以呼吸链缺陷定义，该概念已扩展到包括线粒体翻译、脂质组成、动力学（分裂和融合）以及调控线粒体稳态的核基因异常。在理解线粒体疾病的分子基础和遗传病因方面已取得显著进展，特别是通过下一代测序和全外显子组测序（NGS/WES）。这些方法提供了对神经退行性疾病中涉及基因的见解，并阐明了线粒体功能障碍在其发病机制中的作用。强大的遗传诊断现在能够分析数千个患者基因组，促进先前未解决病例的分子诊断，并揭示新的遗传和致病机制。NGS已彻底改变了nDNA相关线粒体疾病的诊断，在某些情况下将诊断率从<20%提高到>60%。
图1 线粒体核糖体蛋白（MRP）缺陷与神经元易感性增加相关的致病级联示意图（原始图由作者使用ChatGPT, OpenAI创建）。
线粒体疾病由mtDNA或nDNA的遗传性或新生突变引起，影响定位于线粒体的蛋白或RNA。人类细胞含有两个基因组和翻译系统：核基因组（约3×10
9 bp，30,000–40,000个基因）由细胞质核糖体翻译，以及线粒体基因组（16,850 bp，编码13个mRNA、2个rRNA和22个tRNA）。至少1,500个核编码蛋白被输入到线粒体（约3%）。细胞质核糖体包含四个rRNA（28S、18S、5.8S、5S）和85个蛋白；其基因已完全定位并充分表征。
编码细胞质翻译机器组分的基因突变——包括核糖体蛋白和相关因子——已与多种人类疾病相关。尽管线粒体翻译缺陷可影响所有组织，但累积证据表明神经元是一个特别易感的细胞群体。这种易感性可能反映了高ATP需求、依赖氧化磷酸化和有限再生能力的汇聚。因此，即使线粒体蛋白质合成的适度减少也可能损害呼吸链生物发生，并触发生物能量、氧化还原和蛋白质稳态紊乱的级联反应，逐渐损害神经元功能和存活。这些观察结果支持以下观点：线粒体翻译缺陷不仅是神经退行性变的后果，而且可能构成几种线粒体神经疾病的主要致病驱动因素。最近的研究进一步强化了神经元群体对线粒体蛋白质稳态和翻译扰动异常敏感的概念。鉴于其高能量需求、依赖氧化磷酸化以及长寿命的有丝分裂后特性，神经元特别易感于线粒体蛋白质合成缺陷，这可能会损害呼吸链组装、触发整合应激反应，并最终促进神经退行性变。
相比之下，线粒体核糖体（mitoribosome）的组分由核基因组和线粒体基因组共同编码，对氧化磷酸化机器的合成至关重要。线粒体核糖体已在酵母（作为真核细胞生物学的模型系统）和人类（因其与人类健康的相关性）中进行了广泛研究。线粒体rRNA由mtDNA编码，而核糖体蛋白由核基因组编码、在细胞质核糖体上合成，随后输入到线粒体（图2）。在细胞器内部，这些蛋白与两个rRNA组装形成功能性线粒体核糖体，翻译13个mtDNA编码的mRNA。与细胞质核糖体及其细菌祖先不同，线粒体核糖体富含蛋白而非RNA；例如，人类细胞质核糖体含有约7,500个碱基的rRNA，而线粒体核糖体仅有约2,000个碱基，但两者均含有约80个核糖体蛋白（26）。
图2 线粒体核糖体生物发生示意图：线粒体rRNA由线粒体DNA（mtDNA）编码，而核糖体蛋白由核基因组编码、在细胞质核糖体上翻译，随后输入到线粒体。（原始图由作者使用ChatGPT, OpenAI创建）。
关于线粒体蛋白质合成，mtDNA编码13个氧化磷酸化所需的必需蛋白，该过程是线粒体产生ATP以满足细胞生长、分化和发育所用大部分能量需求的方式。相应mRNA的翻译在线粒体核糖体上进行。干扰这些蛋白的合成——无论是通过缺失或突变编码它们的线粒体基因，还是线粒体翻译机器的其他组分如线粒体tRNA——已知会引起一系列严重程度不同的线粒体疾病，包括肌病和感觉神经性疾病如失明和耳聋。类似地，线粒体核糖体功能所需的78个蛋白中任何一个的缺失或突变预期也会导致线粒体疾病。事实上，一些编码线粒体核糖体蛋白（MRPs）的基因已被定位到与人类疾病相关的染色体位点，包括耳聋、视网膜色素变性和Usher综合征1E型。现在几乎所有人类MRPs的序列信息均可获得，并且生物信息学的进步使得将多个其他MRPs的缺陷作为线粒体疾病的潜在候选者成为可能。随着高通量测序的出现，已鉴定出越来越多核编码的线粒体基因突变。例如，翻译延伸因子中的常染色体隐性突变导致脑病和心肌病（TSFM）或白质脑病（TUFM）等表型。影响线粒体翻译的突变已在核心线粒体核糖体蛋白（MRPS16、MRPS22、MRPL12）和辅助蛋白（ObgH1、C7orf30）中鉴定出。MRPS16和MRPS22突变使线粒体核糖体不稳定，而MRPL12参与延伸因子招募和线粒体基因表达的调控。翻译受损可破坏特定或所有OXPHOS复合体的组装，突出了线粒体翻译的严格调控。在过去5年中，冷冻电镜的进展彻底改变了我们对线粒体核糖体结构和生物发生的理解，使得鉴定参与核糖体亚基组装和线粒体翻译调控的新因子成为可能。同时，许多研究强调了编码线粒体核糖体蛋白（MRPs）和组装因子的基因变异在致病中的作用，将其与广泛的多系统疾病联系起来。此外，对线粒体功能障碍在神经退行性过程中贡献的兴趣日益增长，特别是通过生物能量学、线粒体动力学、线粒体自噬和线粒体蛋白质合成的改变。
线粒体功能障碍与重金属和类金属氧阴离子（包括碲（Te））的毒性相关，碲与神经退行性疾病有关。Te暴露产生随年龄变化的神经毒性效应：在胎儿和新生儿中引起致畸性脑积水，在断乳期引起脱髓鞘性周围神经病变和中枢性髓鞘形成不足，在成年大鼠中引起伴认知障碍的脑脂褐质沉积症——这种模式类似于Kuf病和阿尔茨海默病。Te可直接损害线粒体能量代谢，可能促进神经退行性变。硒缺乏（可能拮抗Te毒性）在阿尔茨海默病大脑中进一步支持了Te在疾病发病机制中的作用。
3 拟议的三种线粒体核糖体蛋白的分离与表征实验策略
该研究策略通过整合的细胞、分子和生化方法，研究线粒体核糖体蛋白MRPL44、NAM9和GEP3在人类细胞以及酵母和秀丽隐杆线虫等模型系统中的表达和功能（表1-3）。
表1 拟议实验策略的目标。
a) 使用CRISPR/Cas9技术在人类细胞和模型系统中产生MRPL44、NAM9和GEP3基因的突变；
b) 从野生型和突变型人类细胞以及野生型和突变型模型生物中分离线粒体；
c) 对分离的线粒体进行显微镜、生化和分子表征；
d) 在表达人类tau蛋白的秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型品系中分析MRPL44、NAM9和GEP3基因的表达；
e) 通过克隆和在毕赤酵母或具有增强蛋白输出的酿酒酵母nud1突变体菌株中异源表达，生产和纯化重组MRPL44、NAM9和GEP3蛋白；
f) 体外合成MRPL44、NAM9和GEP3蛋白；
g) MRPL44、NAM9和GEP3蛋白的生化表征；
h) 产生针对MRPL44、NAM9和GEP3蛋白的特异性抗体；
i) 使用相应的特异性抗体对酵母中体内产生的或体外合成的MRPL44、NAM9和GEP3蛋白进行免疫化学分析；
l) 用MRPL44、NAM9和GEP3基因转化亚碲酸盐抗性酿酒酵母突变菌株，以恢复野生型亚碲酸盐敏感性；
m) 在受线粒体神经退行性疾病影响的人类细胞或模型系统（酵母、秀丽隐杆线虫）中恢复健康表型。
表2 表1中概述的实验活动描述。
a) 在MRPL44、NAM9和GEP3基因中产生突变。将使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在人类细胞和模型生物中产生MRPL44、NAM9和GEP3基因的突变。具体而言，将通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑，在人类细胞系和选定的模型系统（包括酵母、秀丽隐杆线虫）中，在每个基因的编码序列中引入靶向修饰。
b) 从人类和模型生物细胞中分离线粒体。将从人类细胞或选自模型生物的细胞中分离线粒体。将使用酶促原生质体制备后差速离心或基于玻璃珠匀浆的快速机械破碎方法制备高度纯化的线粒体组分。
c) 野生型和突变型细胞中线粒体的显微镜、生化和分子表征。将从野生型和突变型人类细胞或模型生物中分离的线粒体在显微镜、生化和分子水平上进行表征，通过：- 共聚焦显微镜共定位分析。- 使用标志酶（包括琥珀酸脱氢酶、腺苷酸激酶、延胡索酸酶和异柠檬酸脱氢酶）评估线粒体纯度。- 线粒体活性的功能评估，包括Krebs循环、呼吸链和氧化磷酸化（OXPHOS）的分析。- 用于系统鉴定线粒体蛋白的蛋白质组学分析，用于确定线粒体脂质组成的脂质组学分析，以及用于表征线粒体代谢物的代谢组学分析。
d) 在表达人类tau蛋白的重组秀丽隐杆线虫阿尔茨海默病模型中分析修饰的MRPL44、NAM9和GEP3基因的表达。将在表达人类tau基因的转基因秀丽隐杆线虫品系中分析CRISPR/Cas9诱导的MRPL44、NAM9和GEP3基因突变。或者，将携带CRISPR/Cas9介导的MRPL44、NAM9和GEP3修饰的秀丽隐杆线虫品系与表达人类tau的转基因秀丽隐杆线虫品系杂交，后者重现了阿尔茨海默病表型。然后在所得重组后代中评估基因表达水平。
e) 通过酵母系统异源表达生产和纯化MRPL44、NAM9和GEP3蛋白。MRPL44、NAM9和GEP3的编码序列将被克隆到适当的表达载体中，并转化到毕赤酵母或具有增强蛋白输出的酿酒酵母nud1突变菌株中。重组蛋白将使用标准蛋白纯化程序从转化的酵母细胞中提取和纯化。
f) 体外合成MRPL44、NAM9和GEP3蛋白。将从相应的编码序列开始，使用无细胞表达系统体外合成MRPL44、NAM9和GEP3蛋白。
g) MRPL44、NAM9和GEP3蛋白的生化表征。将通过质谱分析（电喷雾电离质谱、MS/MS和MALDI-TOF）表征MRPL44、NAM9和GEP3蛋白，以获得每种蛋白的肽图谱、全长氨基酸序列和潜在翻译后修饰的信息。从这些生化程序获得的中间结果（N端序列）以及最终结果（完整蛋白序列）将使用搜索算法（SRS、FASTA、BLAST）和比对工具（ClustalX等）对蛋白数据库（Swiss-Prot、EMBL等）进行生物信息学分析。
h) 产生针对MRPL44、NAM9和GEP3的抗体。将在新西兰白兔中产生针对MRPL44、NAM9和GEP3蛋白的多克隆抗体。
i) 对酵母中体外和体内产生的MRPL44、NAM9和GEP3蛋白进行免疫化学分析。将使用相应的特异性抗体，通过免疫化学分析法对酵母中体外和体内产生的MRPL44、NAM9和GEP3蛋白进行分析。定量和定性检测将使用夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）。
l) 用MRPL44、NAM9和GEP3基因转化亚碲酸盐抗性酿酒酵母突变菌株，以恢复野生型亚碲酸盐敏感表型。将分别用携带MRPL44、NAM9和GEP3编码序列的适当表达质粒转化亚碲酸盐抗性酿酒酵母突变菌株。目的是评估每个基因的表达是否恢复野生型亚碲酸盐敏感表型。
m) 在受线粒体神经退行性疾病影响的人类细胞和模型系统中恢复健康表型。将评估在受线粒体神经退行性疾病（如阿尔茨海默病和帕金森病）影响的人类细胞和模型生物（酵母、秀丽隐杆线虫）中恢复健康表型。恢复将通过适当的饮食和生活方式干预来促进。在酵母和秀丽隐杆线虫模型中，可以通过改变生长培养基组成或喂养方案来模拟饮食效应。此外，在酵母和秀丽隐杆线虫中，可以设计喂养方案以分别给予线粒体核糖体蛋白MRPL44、NAM9和GEP3，作为旨在靶向线粒体并保护神经元细胞免受突变蛋白诱导毒性的候选分子。
表3 拟议研究策略的预期结果。
- 通过CRISPR/Cas9基因组编辑在人类细胞或模型系统（如表现出阿尔茨海默样表型的酵母、秀丽隐杆线虫）中获得并分离MRPL44、NAM9和GEP3突变菌株。
- 从上述人类或模型生物细胞的野生型和突变型菌株中分离并生化表征线粒体。
- 将MRPL44、NAM9或GEP3缺陷的秀丽隐杆线虫品系与表达人类tau基因的转基因阿尔茨海默病秀丽隐杆线虫模型杂交，预期会挽救与阿尔茨海默样表型相关的运动缺陷。
- 体内和体外产生MRPL44、NAM9和GEP3蛋白，随后进行其生化和免疫化学表征。
- 在携带克隆的MRPL44、NAM9或GEP3基因的亚碲酸盐抗性酿酒酵母突变菌株的转化体中恢复对亚碲酸盐的野生型敏感性。
- 开发基于适当饮食和/或生活方式干预的喂养方案，用于人类细胞或模型系统（酵母、秀丽隐杆线虫），旨在恢复健康表型。
- 建立使用纯化的线粒体核糖体蛋白（MRPL44、NAM9和GEP3）作为靶向和保护性分子的喂养方案，以维持表现出阿尔茨海默样表型和突变蛋白诱导毒性的酵母和秀丽隐杆线虫模型中的线粒体功能。
4 结论
几年前，Te被用于研究线粒体的原核起源。最近，它已被用作神经退行性疾病研究中的调查工具，以酿酒酵母为模型系统。通过经典遗传学、基因组学和分子生物学方法，鉴定出三个核基因，编码两个线粒体核糖体蛋白（MRPL44和NAM9）和一个线粒体核糖体生物发生因子（GEP3）。这些基因的突变与帕金森病和阿尔茨海默病相关。
重要的是，Te化合物能够将线粒体核糖体蛋白鉴定为基因功能障碍与神经退行性变之间的机制联系。特别是，这些核基因的突变赋予酿酒酵母Te抗性，而Te毒性先前已与神经退行性疾病的发作相关。这些发现增进了我们对参与亚碲酸钾抗性的线粒体核糖体蛋白的理解，并为研究它们对神经退行性发病机制的潜在贡献提供了框架。
神经退行性疾病中基因突变的鉴定正在重塑我们对致病机制的理解，并使得开发靶向治疗策略成为可能。对遗传上同质的群体进行严格研究对于描绘自然史以及建立用于临床试验的稳健生物标志物和纵向终点至关重要。线粒体功能障碍正日益被认为是临床异质性疾病中的汇聚机制，这得到了基于组学的核-线粒体串扰见解的扩展支持。
在此背景下，线粒体核糖体蛋白（MRPs）值得重点关注，作为潜在的主要疾病决定因素或已建立致病性变异（如mt-tRNA和mt-rRNA突变）的遗传修饰因子。线粒体翻译缺陷的体内模型对于阐明这些作用至关重要。除了它们在翻译中的经典功能外，MRPs还可能参与OXPHOS组装、选择性蛋白输入和线粒体蛋白质稳态的调控。
总体而言，本文回顾的证据突出了一个具有日益增长的科学和临床相关性的领域。尽管取得了显著进展，但重要的知识空白仍然存在，特别是在诊断标准的标准化、预后分层和可靠生物标志物的鉴定方面。在此背景下，分离和功能表征与神经退行性线粒体疾病相关的线粒体蛋白——特别是MRPL44、NAM9和GEP3——似乎既及时又高度相关。
对线粒体途径的持续机制性剖析正在加速线粒体靶向疗法的开发，强化了阿尔茨海默病、帕金森病、癌症和糖尿病等主要疾病在不久的将来可能变得日益可控的前景。
