大麻素受体1抑制外周神经系统中的神经肽Y转录以介导镇痛

《Journal of Biological Chemistry》：The cannabinoid receptor 1 suppresses neuropeptide Y transcription in the peripheral nervous system to mediate analgesia

　　

大麻素受体1（CB₁）介导大麻素诱导的镇痛，然而针对CB₁的疗法在神经病理性疼痛（NP）中的临床疗效不佳。本研究旨在阐明感觉神经元中CB₁介导镇痛的分子机制，并鉴定潜在的治疗靶点。研究人员在雄性小鼠中建立了慢性压迫性损伤（CCI）模型，并使用von Frey纤维丝和热板测试评估疼痛相关行为。通过转录组测序筛选CB₁条件性敲除和神经损伤后背根神经节（DRG）中的差异表达基因（DEGs），关键DEGs通过qPCR和免疫荧光验证。利用ChIP-qPCR和荧光素酶报告基因实验进一步验证激活转录因子3（ATF3）与神经肽Y（NPY）之间的转录相互作用。研究人员证实，感觉神经元CB₁在生理和神经病理性条件下均发挥重要的镇痛作用。CCI诱导的DRG中CB₁下调损害了CB₁激动剂的镇痛效果。感觉神经元中CB₁的基因缺失激活了ATF3和NPY的转录，导致持续性痛觉超敏。神经损伤后，DRG中CB₁的表达被抑制，而ATF3和NPY的转录被激活。ATF3转位进入细胞核，随后驱动NPY的转录。一致地，沉默ATF3或NPY有效缓解了由CCI或CB₁条件性敲除诱导的痛觉超敏。总之，研究结果表明，CB₁可能通过间接抑制ATF3/NPY信号级联发挥镇痛作用。靶向ATF3/NPY信号为神经病理性疼痛提供了一种有前景的替代治疗策略，克服了传统CB₁激动剂的临床局限性。

**论文解读：大麻素受体1通过抑制ATF3/NPY信号通路在外周神经系统中发挥镇痛作用**

**研究背景与问题**

神经病理性疼痛（NP）是全球疾病负担的主要因素之一，由于其复杂的神经和免疫病理生理机制尚未完全阐明，目前缺乏特异性治疗手段。内源性大麻素系统是神经系统中伤害性传递的关键调节因子，大麻素受体1（CB₁）作为Gi/o蛋白偶联受体，主要表达于神经元突触前膜，介导内源性大麻素诱导的镇痛。已有研究表明，外周感觉神经元中CB₁的敲除可导致生理性痛觉超敏，并加剧慢性压迫性损伤（CCI）引起的NP，提示感觉神经元CB₁在生理和病理性疼痛中均发挥关键作用。然而，CB₁激动剂在NP患者中镇痛效果有限，且易引发严重的中枢神经系统副作用。因此，探究CB₁介导镇痛的分子机制并寻找替代治疗靶点具有重要临床意义。激活转录因子3（ATF3）是神经损伤或过度激活的标志物，神经损伤后快速诱导并调节下游基因转录。神经肽Y（NPY）是哺乳动物中枢和外周神经系统中高度保守的内源性肽，参与NP的调节。但ATF3和NPY是否与CB₁相互作用，以及它们能否作为CB₁的替代镇痛靶点尚不清楚。本研究旨在阐明感觉神经元CB₁的镇痛作用，探讨CB₁激动剂对NP疗效不佳的原因，并筛选和鉴定CB₁镇痛通路的下游分子ATF3和NPY，揭示它们在神经损伤后DRG中的表达和调控关系，最终验证干预这些分子能否发挥镇痛效果，以克服CB₁激动剂作为靶点的不足。该论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

**主要技术方法**

研究人员采用雄性C57BL/6小鼠和通过基因敲除技术构建的感觉神经元特异性CB₁条件性敲除（CB₁ cKO）小鼠（来源于Advillin-CreERT2与Cnr1^flox/flox小鼠杂交），建立CCI模型。主要方法包括：von Frey纤维丝和热板测试进行疼痛行为学评估；转录组测序（RNA-seq）筛选DRG中差异表达基因；实时定量PCR（qPCR）和免疫荧光（IF）验证基因表达；染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）和双荧光素酶报告基因实验验证ATF3与NPY启动子的结合及转录调控；通过鞘内注射慢病毒介导的shRNA沉默ATF3或NPY，观察疼痛行为变化。样本来源：所有动物实验经中山大学附属第五医院动物伦理委员会批准。

**研究结果**

1. **感觉神经元CB₁调节基础痛阈和神经损伤诱导的NP**
通过CCI模型发现，损伤侧L4-L6 DRG中CB₁ mRNA和蛋白表达显著下调。CB₁拮抗剂AM251进一步加剧CCI诱导的NP，而CB₁激动剂ACEA在CCI后7-14天无显著镇痛效果。感觉神经元CB₁ cKO小鼠在无CCI情况下也出现持续性机械痛觉超敏，CCI后疼痛更严重。表明CB₁在感觉神经元中调节基础痛阈和神经损伤后NP。

2. **ATF3和NPY是CB₁信号通路下游的关键分子**
转录组测序显示，CB₁ cKO后28天（而非14天）ATF3和NPY mRNA水平显著升高，CCI进一步上调其表达。qPCR和IF证实，CB₁ cKO或AM251处理可增加DRG中ATF3和NPY水平。IF显示，CB₁ cKO后ATF3主要位于胞质，CCI后转入核内；NPY在CB₁ cKO后主要表达于神经纤维，CCI后主要分布于神经元胞体。

3. **神经损伤后ATF3主要表达于DRG的CGRP⁺和IB4⁺神经元**
IF和qPCR显示CCI后DRG中ATF3显著增加，主要位于神经元核内。CCI后1天ATF3 mRNA开始升高，7天达峰。定量分析表明，ATF3在CGRP⁺（肽能C纤维和部分Aδ纤维标志物）和IB4⁺（非肽能C纤维标志物）神经元中高表达，分别占ATF3⁺神经元的27%和5.7%。

4. **神经损伤后NPY主要表达于DRG的CGRP⁺神经元**
CCI后DRG神经元中NPY表达显著增加，mRNA水平变化趋势与ATF3一致。NPY在CGRP⁺神经元中高表达（50.5%的CGRP⁺神经元表达NPY），在NPY⁺神经元中79.7%共表达CGRP，而在IB4⁺神经元中几乎不表达。

5. **沉默ATF3导致NPY转录抑制**
在N2a细胞中，ATF3 shRNA（95号和96号）可显著下调NPY mRNA，而NPY shRNA对ATF3无影响。荧光素酶报告基因实验显示，敲低ATF3后NPY启动子活性下降。在CCI小鼠中鞘内注射ATF3 shRNA慢病毒，DRG中ATF3和NPY蛋白水平均降低。表明ATF3可能调控NPY转录。

6. **ATF3不能独立调控NPY转录**
ChIP-qPCR证实ATF3直接结合NPY启动子区域。但荧光素酶报告基因实验中，ATF3过表达未改变NPY启动子活性；在293T细胞中过表达ATF3未影响NPY mRNA水平。经LPS刺激的BV2细胞上清处理N2a细胞后，ATF3上调而NPY下调。说明ATF3虽结合NPY启动子，但需其他因子辅助才能激活转录。

7. **沉默ATF3缓解CCI和CB₁ cKO引起的痛觉超敏**
CCI小鼠鞘内注射ATF3 shRNA后，DRG中ATF3 mRNA下降，机械触诱发痛和热痛觉超敏显著逆转。在CB₁ cKO小鼠中，沉默ATF3同样逆转了机械痛觉超敏，但对热痛觉超敏效果不显著。

8. **沉默NPY缓解CCI和CB₁ cKO引起的痛觉超敏**
CCI小鼠鞘内注射NPY shRNA后，DRG中NPY mRNA下降，机械痛和热痛觉超敏被逆转。在CB₁ cKO小鼠中，沉默NPY也逆转了机械痛觉超敏，对热痛觉超敏无显著效果。

**总结与讨论**

本研究阐明，DRG感觉神经元中的CB₁在生理和神经损伤后发挥内源性镇痛作用，但神经损伤后CB₁表达下调导致其激动剂疗效有限。进一步发现，CB₁通过间接抑制ATF3/NPY信号级联发挥镇痛效应：CB₁缺失或拮抗可解除对ATF3的抑制，ATF3进入核内并作为辅助因子促进NPY转录，NPY作为促伤害性肽引起持续痛觉超敏。干预ATF3或NPY可有效缓解CCI或CB₁ cKO引起的痛觉超敏，为NP治疗提供了替代CB₁激动剂的新策略。研究结论部分翻译如下：总之，本研究阐明抑制ATF3的激活和NPY的表达可能是CB₁在感觉神经元中发挥镇痛作用的关键机制之一。靶向ATF3或NPY以缓解NP有望取代CB₁激动剂。因此，干预CB₁镇痛通路的下游靶点可能是治疗NP的新策略。