基于分子印迹电化学技术检测汗液中的肌醇三焦磷酸——一种新兴的氧传递掺杂剂

《Analytica Chimica Acta》：Molecularly Imprinted Electrochemical Detection of Inositol Trispyrophosphate in Sweat as an Emerging Oxygen-Transfer Doping Agent

　　

摘要：

背景

肌醇三焦磷酸（ITPP）是一种高极性、多磷酸化的血红蛋白变构效应剂，有可能被滥用来提升氧气输送能力。现有的ITPP检测方法主要依赖于实验室中的色谱-质谱技术，以尿液或血浆为检测样本，这类方法虽适合确认性分析，但不太适用于快速、无创的初步筛查。汗液作为运动监测的采样介质具有很大优势，但ITPP在复杂的汗液环境中电化学活性较低，难以被选择性识别。因此，需要一种适用于汗液的快速检测策略，用于ITPP的初步筛查。

结果

我们开发了一种分子印迹电化学传感器，通过在含有ITPP的环境中电聚合吡咯，从而在玻璃碳电极上的聚吡咯膜中形成识别腔。去除模板后，ITPP会重新结合到该腔中，阻碍铁氰化物氧化还原探针的传输，进而导致DPV电流随浓度增加而下降。FT-IR光谱、氢键竞争实验、吸附热力学以及DFT计算均表明，该传感器的识别机制是基于多价氢键以及磷酸基团与氧化态聚吡咯NH⁺位点之间的静电互补作用。该传感器可检测50-1500 ng/mL范围内的ITPP，其计算检出限为11.3 ng/mL，定量限为34.2 ng/mL。在汗液相关的pH 5.0-7.0范围内，该传感器仍能保持良好性能，对结构类似物及汗液中的干扰物质反应较弱，在添加了标准样品和真实汗液样本的测试中，回收率在94.3%-104%之间，相对标准偏差低于5%。

意义

这项研究建立了一种概念验证型的MIP-EC平台，可用于汗液中ITPP的快速、无创初步筛查。该传感器并非要取代LC-MS/MS或LC-HRMS等确认性分析方法，而是为那些高极性、电化学活性低的检测目标提供了一种补充性的初步检测手段，同时也为未来开发适用于汗液的反兴奋剂检测设备及相关生物流体检测技术提供了理论基础。

引言

肌醇三焦磷酸（ITPP）是一种强大的血红蛋白变构效应剂，能够通过稳定血红蛋白的脱氧状态来提升组织缺氧区域的氧气输送能力，从而显著提高临床前模型中的运动耐力。⁴尽管目前尚未有运动员出现使用该物质的阳性案例，但由于其与违禁药物Efaproxiral?结构相似，再加上2022年至2024年间马匹兴奋剂事件频发（共23起），世界反兴奋剂机构对此极为关注。⁵, ⁶, ⁷该化合物代谢速度快，还可能隐藏在营养补充剂中，给检测工作带来了巨大挑战，现有检测方法往往难以应对。⁸目前的兴奋剂检测主要依靠实验室中的质谱技术，如液相色谱-串联质谱法和亲水相互作用液相色谱-高分辨率质谱法。⁵, ⁶, ⁸这些方法需要采集具有侵入性的血液或尿液样本，且分析流程复杂，从样本采集到得出结果通常需要超过两小时的时间。⁹这样的分析延迟与ITPP的短检测窗口存在矛盾，而且这些方法成本高昂、具有侵入性，难以大规模应用。虽然离子色谱-高分辨率质谱法等替代方法的灵敏度更高，但其较长的检测窗口可能导致结构相似的治疗用化合物出现假阳性结果。⁶

电化学传感技术因其具备快速分析、便携性强、成本低等优点，成为即时检测的一种理想选择。¹⁰, ¹¹, ¹²然而，将其应用于ITPP检测时面临诸多限制：该分子本身电化学活性较低，没有直接的氧化还原活性，且复杂的生物环境容易产生大量干扰信号。为了解决非电活性物质的检测难题，分子印迹技术应运而生，成为一种有效的解决方案。¹³, ¹⁴分子印迹聚合物与电化学传感技术的结合，为实现特定物质的精准检测提供了可行途径。¹⁵要提升传感器的性能，关键在于合理设计并验证其识别位点。¹⁶, ¹⁷本研究通过结合FT-IR光谱、竞争性结合实验、热力学分析以及DFT计算，深入研究了分子间的相互作用机制，证实了传感器能够通过氢键作用实现对ITPP的选择性检测。¹⁸这种研究方法确保了分子印迹电化学传感器并非仅基于经验设计，而是建立在经过验证的分子识别原理之上，从而有效解决了ITPP的检测难题。

汗液作为一种无创且信息丰富的生物流体，越来越受到重视，可用于各种诊断监测。¹⁹汗液采集简单，运动员也能较好地接受，完全符合反兴奋剂检测的要求。目前，各大反兴奋剂机构都在积极探索基于汗液的检测方法，例如美国反兴奋剂机构就与相关企业合作，开发可穿戴式汗液检测技术，以便更频繁、更方便、更无创地采集样本，作为传统血液和尿液检测的补充。此外，汗液还能反映体内分析物的药代动力学特征，为检测提供动态信息。²⁰虽然已有研究将分子印迹电化学传感器用于检测生物流体中的多种小分子，但其在汗液检测中的应用，尤其是针对ITPP这类兴奋剂成分的检测，目前还较少有相关研究。²¹, ²², ²³这为开发新的无创检测工具提供了重要机会。

本研究开发了一种用于汗液中ITPP检测的分子印迹电化学传感器，旨在提供一种快速、无创的初步筛查方法，而非替代实验室中的确认性分析。该传感器是通过在ITPP存在的情况下电聚合吡咯制成的，形成的聚吡咯矩阵中带有印迹腔，这些腔体可通过多价氢键和静电互补作用与ITPP中的阴离子磷酸基团发生相互作用。除了传感器制备之外，我们还通过FT-IR光谱、竞争性结合实验、吸附热力学以及DFT计算等方法研究了其识别机制，从分子层面证明了该传感器的选择性。与以往主要基于尿液或血浆样本的ITPP质谱检测方法不同，本研究探索了利用便携式电化学传感技术检测汗液中ITPP的可行性。通过合理的印迹设计、机制验证以及加标汗液样本测试，本研究为开发针对高极性、电化学活性低的小分子的辅助性、无创检测工具提供了方法学依据。

章节节选

化学品

所有实验均使用超纯水进行，该水的电阻率为25°C时的18.2 MΩ·cm，是由Millipore Sigma Synergy UV水净化系统净化所得。以下化学品购自Sigma-Aldrich：甲醇（CH₃OH，纯度99.5%）和乙酸（CH₃COOH，纯度97%）。高氯酸锂（LiClO₄，纯度99%）、氢氧化钠（NaOH，纯度99%）以及铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆]，纯度95%）则购自Fisher Chemicals公司。肌醇三焦磷酸（ITPP，纯度99%）则由

分子印迹聚合物的特性分析

该传感器的检测机制（见图1）依赖于电聚合聚吡咯矩阵中特定的识别腔对ITPP的识别。去除模板后，这些识别腔会通过定向氢键与ITPP中的磷酸基团重新结合。随后，目标物质与识别腔的结合会从空间上阻碍[Fe(CN)₆]^3-氧化还原探针的电子转移，从而通过DPV峰电流的减弱（ΔI）来实现对ITPP浓度的测定。

该传感器的成功构建

结论

本研究开发了一种分子印迹电化学传感器，可用于无创检测汗液中的ITPP，旨在为这种高极性、电化学活性低的物质提供一种快速初步筛查方法。该传感器是通过在ITPP存在的情况下电聚合吡咯制成的，其内部具有带有阳离子NH⁺位点的印迹腔，可通过氢键作用识别磷酸基团。该传感器的识别机制得到了多种实验方法的支持

作者贡献说明

董一凡：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资源提供、项目管理、方法设计、资金筹集、概念构思。邵元华：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资源提供、项目管理、资金筹集。李阳：论文撰写——初稿撰写、实验研究。游泽航：论文撰写——初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目管理、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理、概念构思。陈晨：实验研究。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究的资金支持来自中国国家自然科学基金（项目编号：22204005、22034001）以及中央高校基本科研业务费（项目编号：2022YB008）。

游泽航目前在北京体育大学攻读运动人体科学硕士学位，他的研究主要集中在电化学传感器和电化学发光传感器领域。

Zehang You|Yang Li|Hanfei Liu|Chen Chen|Tao Mei|Quan Wang|Yifan Dong|Yuanhua Shao

北京体育大学运动科学学院，体育总局运动应力与适应实验室，中国北京市100084