《Frontiers in Immunology》：Recombinant Bacillus subtilis spores expressing cholera toxin B and ovalbumin prevent ovalbumin-specific food allergy in mice by upregulating regulatory T cells and modulating gut microbiome flora
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摘要背景：尽管口服免疫治疗在治疗食物过敏方面显示出临床疗效，但其更广泛的应用受到不良事件发生的限制。因此，在生命早期诱导过敏原特异性免疫耐受可作为一种预防策略，以减少食物过敏的发展。目的：在此，研究人员开发了一种新型融合蛋白霍乱毒素B（cholera toxi
摘要背景：尽管口服免疫治疗在治疗食物过敏方面显示出临床疗效，但其更广泛的应用受到不良事件发生的限制。因此，在生命早期诱导过敏原特异性免疫耐受可作为一种预防策略，以减少食物过敏的发展。目的：在此，研究人员开发了一种新型融合蛋白霍乱毒素B（cholera toxin B, CTB）-卵清蛋白（ovalbumin, OVA），表达在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）孢子表面（B.s-CotC-CTB-OVA），并研究B.s-CotC-CTB-OVA孢子是否在小鼠模型中预防OVA诱导的食物过敏，并探索潜在机制。方法：采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blot）确认CTB-OVA在枯草芽孢杆菌孢子上表达。雌性BALB/c小鼠口服给予B.s-CotC-CTB-OVA孢子及对照孢子（B.s-CotC和B.s-CotC-CTB）4周。随后对小鼠进行OVA致敏和激发。通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测量粪便OVA分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA, sIgA）和血清OVA-IgE、IgG1、IgG2a水平。通过16S rDNA测序分析肠道微生物组。激发后，记录腹泻评分、过敏反应评分，并测量脾细胞白细胞介素（interleukin, IL）-10、IL-4、干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）及调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）水平。测量IL-10、IL-4、IFN-γ和叉头框蛋白P3（forkhead box P3, Foxp3）的mRNA。采用粪菌移植（fecal microbiota transplant, FMT）探索微生物组在枯草芽孢杆菌对食物过敏影响中的作用机制。结果：重组CTB-OVA成功表达在枯草芽孢杆菌表面。口服B.s-CotC-CTB-OVA可增加粪便OVA-sIgA，减轻食物过敏症状，并显著降低血清OVA-IgE（p < 0.05）。此外，口服B.s-CotC-CTB-OVA可显著降低血清OVA-IgG1、OVA-IgG2、IL-4、脾脏肥大细胞和嗜酸性粒细胞水平，并显著增加血清IL-10和Treg水平（p < 0.05）。此外，微生物组分析显示，口服B.s-CotC-CTB-OVA可显著增加Muribaculaceae的相对丰度，并显著降低Alistipes的相对丰度。FMT部分重现了血清OVA特异性IgE的降低，但未显著改善过敏症状或腹泻评分，提示肠道微生物群改变可能部分贡献于B.s-CotC-CTB-OVA的免疫学效应。结论：这些发现表明，B.s-CotC-CTB-OVA孢子可能作为一种预防性口服抗原递送策略，促进抗原特异性免疫调节并部分调节微生物群相关的免疫反应，在OVA诱导的食物过敏中。
食物过敏已成为全球性公共卫生问题，口服免疫治疗（OIT）虽有一定疗效，但约10%–20%的患者因不良事件（如胃肠道症状）而中断治疗，且多数患者无法实现长期持续的无应答状态。早期低剂量过敏原暴露（尤其在免疫系统成熟前）可通过黏膜表面诱导免疫耐受，而肠道微生物组组成也与食物过敏和哮喘的发生相关。基于此，研究人员开发了一种新型口服疫苗：表达霍乱毒素B（CTB）和卵清蛋白（OVA）融合蛋白的重组枯草芽孢杆菌孢子（B.s-CotC-CTB-OVA），旨在通过生命早期预免疫诱导免疫耐受，预防OVA诱导的食物过敏，并探讨其与微生物组的相互作用。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。
主要关键技术方法包括：通过基因重组构建pUS186-CotC-CTB-OVA质粒，转化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB600，经SDS-PAGE和Western blot验证孢子表面CTB-OVA融合蛋白表达；使用雌性BALB/c小鼠（来自广东医学实验动物中心）建立OVA食物过敏模型，口服孢子处理4周后致敏和激发；通过ELISA检测抗体和细胞因子，流式细胞术分析脾脏Treg、肥大细胞和嗜酸性粒细胞，qPCR检测空肠免疫相关基因表达，16S rRNA基因测序分析粪便微生物组，并采用粪菌移植（FMT）探究微生物组的作用。
**结果**
1. **表达CTB-OVA蛋白在枯草芽孢杆菌孢子中**：通过PCR扩增CTB-OVA基因并构建pUS186CotC-CTB-OVA质粒，转化后经SDS-PAGE和Western blot检测到孢子表面42.9 kDa的CTB-OVA融合蛋白，证明成功表达。
2. **口服B.s-CotC-CTB-OVA孢子增强粪便OVA特异性sIgA产生并减轻OVA诱导的过敏反应**：口服B.s-CotC-CTB-OVA孢子4周后，小鼠粪便OVA-sIgA显著升高（p < 0.01）；OVA激发后，过敏症状评分和腹泻评分均显著降低（p < 0.05），表明过敏表现减轻。
3. **口服B.s-CotC-CTB-OVA孢子抑制OVA特异性抗体反应并促进IL-10产生**：与模型和B.s-CotC组相比，B.s-CotC-CTB-OVA组血清OVA-IgE、IgG1、IgG2a显著降低（p < 0.05），脾脏IgE
+细胞频率减少；OVA刺激的脾细胞上清中IL-4显著降低，IL-10显著升高（p < 0.05），IFN-γ呈上升趋势但无统计学差异。
4. **口服B.s-CotC-CTB-OVA孢子减少脾脏肥大细胞和嗜酸性粒细胞，增加Treg细胞**：流式细胞术显示，B.s-CotC-CTB-OVA组脾脏肥大细胞（c-kit
+IgE
+）和嗜酸性粒细胞（CD11b
+Siglec-F
+）频率显著低于模型和B.s-CotC组，而Treg（CD4
+CD25
+Foxp3
+）频率显著升高（p < 0.05）。
5. **口服B.s-CotC-CTB-OVA孢子调节空肠免疫相关基因表达**：qPCR结果显示，B.s-CotC-CTB-OVA组空肠IL-4 mRNA显著降低（p < 0.001），IL-10和Foxp3 mRNA显著升高（p < 0.001），IFN-γ mRNA无显著变化，提示肠道局部调节性免疫特征增强。
6. **口服B.s-CotC-CTB-OVA孢子后的微生物组特征**：16S rRNA测序显示，口服枯草芽孢杆菌孢子后，小鼠粪便微生物组β-多样性（基于Bray–Curtis距离）与未处理组分离；与未处理组相比，B.s-CotC-CTB-OVA组Muribaculaceae相对丰度显著增加，Alistipes相对丰度显著降低（p < 0.05），但Lactobacillus、Odoribacter、Desulfovibrio等属无显著差异。
7. **FMT部分重现B.s-CotC-CTB-OVA处理诱导的血清OVA特异性IgE降低**：接受B.s-CotC-CTB-OVA组供体粪菌的受体小鼠，在OVA激发后血清OVA-IgE显著低于对照组（p < 0.05），但过敏症状评分和腹泻评分无显著改善，提示微生物组改变部分贡献于免疫效应，但不足以完全重现临床保护。
**讨论与结论**
讨论部分指出，早期低剂量过敏原暴露可促进免疫耐受，而枯草芽孢杆菌孢子作为递送载体具有抗胃酸降解、稳定递送抗原的优势。B.s-CotC-CTB-OVA处理通过增加粪便sIgA、降低IgE/IgG1/IL-4、减少过敏效应细胞、增加Treg和IL-10/Foxp3表达，调节了系统性及局部肠道免疫应答，而非简单的Th1/Th2转换。微生物组分析显示孢子处理与Muribaculaceae增加和Alistipes减少相关，但FMT仅部分重现IgE降低，提示微生物组改变是部分机制，持续抗原递送可能更重要。研究局限性包括未直接分析肠道Treg、未测量其他Ig亚类、未进行功能微生物组分析、未控制同笼效应及未评估长期保护效果。结论：口服B.s-CotC-CTB-OVA孢子通过促进抗原特异性免疫调节和部分调节肠道微生物组相关免疫反应，减轻了OVA诱导的食物过敏反应，支持其作为食物过敏预防口服策略的潜力。
