核IL-33通过放大NF-κB信号驱动生殖支原体感染期间宫颈内膜上皮的中性粒细胞招募和激活

《Frontiers in Immunology》：Nuclear IL-33 amplifies NF-κB signaling to drive neutrophil recruitment and activation in the endocervical epithelium during Mycoplasma genitalium infection

　　

生殖支原体（Mycoplasma genitalium）已成为性传播感染中具有临床意义的病因，常在女性生殖道内建立持续性感染。尽管中性粒细胞招募是M. genitalium相关宫颈炎的特征性表现，但黏膜界面调控这一反应的分子机制仍不完全清楚。在本研究中，研究人员观察到用M. genitalium感染宫颈内膜上皮细胞可诱导IL-33蛋白显著增加，并定位于细胞核内。编码IL-33的基因转录诱导由涉及Toll样受体2（Toll-like receptor 2, TLR2）和TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1, TBK1）的信号轴介导，该信号轴导致干扰素调节因子1（Interferon Regulatory Factor 1, IRF1）和7（IRF7）的核转位及启动子结合。在细胞核内，IL-33与NF-κB的p65亚基形成物理复合物。该相互作用促进了p65在编码CXCL1和IL-8的基因启动子上的招募和占据，从而特异性地放大了这些趋化因子的分泌。功能实验表明，依赖于核IL-33的趋化因子分泌是中性粒细胞粘附、趋化和氧化激活所必需的。这些发现揭示了一种致病机制，即M. genitalium利用IL-33的核功能驱动慢性中性粒细胞炎症，并促进生殖道的免疫病理过程。

# 论文解读：核IL-33通过放大NF-κB信号驱动生殖支原体感染期间宫颈内膜上皮的中性粒细胞招募和激活

## 研究背景与目的

生殖支原体（*Mycoplasma genitalium*）已成为性传播感染中不可忽视的病原体，其流行率在一般人群中常与沙眼衣原体（*Chlamydia trachomatis*）和淋病奈瑟菌（*Neisseria gonorrhoeae*）相当，甚至在性传播感染门诊人群中更高。与引起急性症状的病原体不同，*M. genitalium* 常导致女性生殖道内持续、低度的无症状感染，但未被识别的感染可能上行至上生殖道，引发宫颈炎和盆腔炎性疾病等严重后遗症。由于全球抗菌药物耐药性菌株日益增多，大环内酯类和氟喹诺酮类耐药导致治疗失败和持续性感染，进而延长宿主炎症和组织损伤。因此，阐明驱动黏膜炎症的宿主信号通路对于识别新型宿主导向治疗靶点至关重要。宫颈上皮是 *M. genitalium* 感染的主要界面，但其诱导中性粒细胞招募的分子机制尚不完全清楚。IL-33 属于IL-1细胞因子家族，在黏膜免疫中发挥重要作用，但其经典功能是作为可溶性警报素（alarmin）从坏死细胞释放。然而，IL-33 还具有核定位基序和染色质结合区，可在核内调节转录活性。在 *M. genitalium* 感染（通常不引起立即裂解）的背景下，IL-33 的作用尚不明确。本研究旨在揭示 *M. genitalium* 感染如何通过核IL-33（nIL-33）驱动中性粒细胞炎症，从而解释宫颈炎的免疫病理机制。

## 研究结论与意义

研究人员发现，*M. genitalium* 感染诱导宫颈内膜上皮细胞中IL-33 mRNA和蛋白水平显著上调，但IL-33主要保留在细胞核内，而非分泌至胞外。这一核内积累依赖于TLR2（Toll-like receptor 2）和TBK1（TANK-binding kinase 1）信号轴，进而激活IRF1（Interferon Regulatory Factor 1）和IRF7（Interferon Regulatory Factor 7），使其转位至核内并结合IL-33启动子。核内IL-33与NF-κB p65亚基形成复合物，增强p65在CXCL1和IL-8基因启动子上的占据，从而特异性放大这些趋化因子的分泌。功能实验表明，依赖核IL-33的趋化因子分泌对于中性粒细胞样细胞的粘附、趋化和氧化激活至关重要。这些发现揭示了一种致病机制：*M. genitalium* 利用IL-33的核功能来放大慢性中性粒细胞炎症，从而促进生殖道免疫病理过程。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

## 主要关键技术方法

研究人员使用人宫颈内膜上皮细胞系End1/E6E7（ATCC CRL-2615）和 *M. genitalium* 菌株G37（ATCC 33530）作为感染模型。关键方法包括：定量PCR（qPCR）和ELISA检测基因表达和蛋白分泌；亚细胞分离和免疫印迹分析蛋白定位；免疫共沉淀（Co-IP）检测蛋白相互作用；染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR评估转录因子和IL-33在启动子区的结合；双荧光素酶报告基因实验评估NF-κB转录活性；使用分化的人早幼粒细胞白血病细胞系HL-60（dHL-60）作为中性粒细胞模型，进行趋化、粘附和氧化激活功能实验。此外，使用了TLR2中和抗体、C29（TLR2抑制剂）、BX795（TBK1抑制剂）等药理抑制剂，以及siRNA/shRNA进行基因沉默。

## 研究结果

### 3.1 *Mycoplasma genitalium* 感染诱导IL-33核积累及CXCL1和IL-8分泌

通过qPCR和ELISA发现，*M. genitalium* 感染以剂量依赖性方式上调IL-33、CXCL1和IL-8的mRNA和蛋白分泌，但IL-33蛋白在培养上清中几乎检测不到。亚细胞分离和免疫印迹显示，IL-33主要分布于核组分，与组蛋白H3共定位，而非胞质组分。乳酸脱氢酶释放实验表明感染未引起细胞毒性，排除了被动泄漏的可能性。

### 3.2 TLR2–TBK1轴介导IL-33 mRNA的转录诱导

膜脂蛋白（而非加热灭活菌）可再现IL-33的诱导。TLR2中和抗体或抑制剂C29显著降低IL-33 mRNA，而TLR4抑制剂TAK-242无效。感染诱导TBK1在Ser172位点磷酸化，TBK1抑制剂BX795或siRNA敲低均显著抑制IL-33上调。免疫共沉淀显示TLR2与TBK1在感染后形成增强的复合物，提示TLR2–TBK1信号轴参与。

### 3.3 IRF1和IRF7是TBK1依赖性IL-33转录诱导所必需的

生物信息学分析发现IL-33启动子含有干扰素刺激反应元件（ISRE）。感染诱导IRF1和IRF7核转位，被TBK1抑制或敲低所阻断。ChIP-qPCR证实感染后IRF1和IRF7在IL-33启动子上的结合显著增加。沉默IRF1或IRF7部分降低IL-33 mRNA和蛋白水平，且不影响细菌负荷。

### 3.4 核IL-33与NF-κB形成核复合物并增强p65驱动的转录激活

免疫共沉淀显示感染后核内IL-33与p65共存于同一复合物。免疫印迹确认核IL-33为全长形式（约31 kDa）。双荧光素酶报告基因实验表明，共表达IL-33与p65显著增强p65介导的NF-κB转录活性，而IL-33单独无此作用。

### 3.5 核IL-33是p65占据CXCL1和IL-8启动子所必需的

IL-33 siRNA敲低后，CXCL1和IL-8分泌显著减少。p65的核转位未受影响，但ChIP-qPCR显示p65在CXCL1和IL-8启动子上的占据显著降低。同时，IL-33本身可被招募至这些启动子区，表明IL-33作为共激活因子促进p65结合。

### 3.6 IL-33/CXCL轴介导中性粒细胞样细胞的粘附、趋化和激活

使用dHL-60细胞进行功能实验：感染后条件培养基（CM）显著增强dHL-60的趋化、粘附以及超氧化物产生和中性粒细胞弹性蛋白酶释放。上皮细胞中IL-33沉默或CM中趋化因子中和抗体混合物均显著削弱这些效应，表明核IL-33依赖的趋化因子是中性粒细胞功能的关键驱动因素。

## 讨论与结论总结

讨论部分指出，*M. genitalium* 感染虽缺乏经典外毒素，却诱导显著中性粒细胞浸润，本研究通过展示病原体利用核IL-33放大炎症信号提供了机制解释。感染激活TLR2–TBK1–IRF1/IRF7轴诱导IL-33转录，并使其保留在核内，而非分泌为警报素。核IL-33与NF-κB p65相互作用，增强CXCL1和IL-8的转录，从而驱动中性粒细胞招募和激活。这一非经典机制将上皮细胞转化为免疫信号中继站，促进慢性炎症。研究还讨论了TBK1的激活类似于伪病毒状态，以及核IL-33功能的环境依赖性（与某些报道的抑制效应相反）。功能实验表明，核IL-33依赖的趋化因子促进中性粒细胞样细胞的功能，但残余趋化活性提示其他趋化因子也可能参与。讨论也承认了局限性：End1/E6E7细胞系为永生化细胞，dHL-60细胞不能完全模拟原代中性粒细胞，缺乏三维组织结构和基质成分。此外，TLR2与TBK1之间的精确分子连接尚不明确。

**研究结论翻译**：本项研究提供了一个分子框架，用于理解 *M. genitalium* 如何操纵核IL-33（nIL-33）来放大中性粒细胞炎症。未来的研究需要使用原代宫颈内膜上皮细胞、三维类器官模型和人源化小鼠感染模型，以确定该通路是否在体内起作用，以及靶向nIL-33或nIL-33与p65的相互作用是否能够改善免疫病理。此外，对感染女性宫颈活检组织进行单细胞RNA测序可能揭示持续性宫颈炎患者中是否存在具有高IL-33表达的类似上皮细胞亚群。