《Frontiers in Neural Circuits》：Transsynaptic viral tools in neural circuit analysis: from anatomical mapping to functional interrogation
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跨突触病毒的应用已经改变了神经环路分析，使得神经元连接图谱的绘制越来越精确。这些方法大致可分为多突触和单突触策略。基于伪狂犬病毒（PRV）的多突触逆行示踪剂，包括经典选育的Bartha毒株和基因工程改造的逆行变体，为啮齿动物的多突触环路组织提供了重要见解。对于
跨突触病毒的应用已经改变了神经环路分析，使得神经元连接图谱的绘制越来越精确。这些方法大致可分为多突触和单突触策略。基于伪狂犬病毒（PRV）的多突触逆行示踪剂，包括经典选育的Bartha毒株和基因工程改造的逆行变体，为啮齿动物的多突触环路组织提供了重要见解。对于多突触顺行示踪，单纯疱疹病毒H129毒株（HSV-1 H129）及其衍生物已被用于映射输出通路，随后的基因修饰提高了可检测性和实验控制性。在过去几年中，越来越多的关注转向基于工程化狂犬病毒（RV）平台并结合腺相关病毒（AAV）辅助系统的单突触示踪，该系统能够实现基因限制性传播至直接突触前伙伴。病毒示踪正越来越多地与功能方法相结合，包括钙成像和电压成像、光遗传学、化学遗传学以及基于重组酶的遗传策略，从而将环路分析从解剖学图谱扩展到对特定神经元群体功能的因果探究。展望未来，对多突触传播的改进控制，连同大转基因容量、适用于追踪层级环路架构以及整合功能读出的能力，有望重新激起对多突触示踪的兴趣。
论文主体部分总结如下：
**1 引言**
神经环路的突触结构是大脑组织的结构基础，推动了基于嗜神经病毒的跨突触示踪工具的发展。历史上，这些方法始于多突触方法以揭示高阶连接性，随后出现了单突触和基因限制性系统。多突触示踪剂通过串联传播以映射高阶环路组织，而单突触系统则将传播限制在单一突触步骤。基于α疱疹病毒的经典多突触系统在揭示多突触环路组织中发挥重要作用：伪狂犬病毒（PRV）毒株经选育或工程化改造用于逆行传播，提供跨多个突触站点的可靠标记；而单纯疱疹病毒1型（HSV-1）H129毒株及其衍生物则实现顺行输出示踪。单突触逆行示踪最常基于工程化狂犬病毒（RV）系统，其中删除病毒糖蛋白基因（RV-G）产生传播缺陷型载体RVΔG，除非通过互补的腺相关病毒（AAV）载体（AAV-RV-G）反式提供RV-G，否则无法进行跨突触传播。辅助载体直接注射入起始区域，转导局部神经元而非跨越突触，从而为目标起始群体提供肿瘤病毒受体A（TVA）和RV-G。用EnvA（禽肉瘤和白血病病毒包膜蛋白A）假型化RVΔG可将初始感染限制于TVA表达细胞。顺行单突触策略包括工程化HSV-1扩增子系统、AAV介导的跨突触标记以及基于合成蛋白的平台。近年来，该领域已转向具有更高安全性和实验控制性的单突触和方向限制性系统，尽管多突触示踪在映射高阶环路架构方面仍保留独特价值。病毒环路分析越来越多地与互补技术整合，包括组织透明化、单细胞转录组学、分子条形码方法、钙成像和电压成像、光遗传学、化学遗传学、基于重组酶和诱导型遗传系统。本综述首先调查了当前可用于环路分析的主要多突触和单突触工具，讨论其应用、局限性和演变角色，然后探讨与功能方法以及分子和高通量策略的整合如何将病毒示踪从纯解剖学图谱策略转变为多模式平台。
**2 经典多突触示踪剂**
**2.1 多突触示踪原理**
用于多突触示踪的α疱疹病毒感染神经元，在细胞核中复制，并通过连接的神经元网络传播。野生型毒株能够进行顺行和逆行传播，而示踪毒株被选育或工程化以偏向某一方向。病毒传播必须足够慢以允许时间推断突触顺序，同时又足够有效以在实验可耐受的存活窗口内标记高阶神经元。这种平衡通常通过减毒实现，减毒延迟细胞病变效应并延长可解析突触进展的时间间隔。理想情况下，病毒传播应主要局限于突触连接神经元，而非反映非特异性细胞外释放。减毒毒株通过延迟细胞病变损伤部分支持这一要求，从而延长局部小胶质细胞遏制可能有助于限制实质病毒扩散的时间间隔。另一个基本要求是表达强健且易于检测的标记物。早期研究依赖于固定组织中的病毒抗原免疫组化检测。携带荧光报告基因的重组毒株允许直接可视化感染神经元，并使得在活脑切片和离体视网膜制备物中识别环路定义神经元以进行电生理和光学功能分析成为可能。
**2.2 α疱疹病毒**
PRV的Bartha毒株最初作为减毒活疫苗开发，成为基础性跨突触示踪剂。us7/gI、us8/gE和us9基因的缺失损害了顺行轴突分选和传播，使传播偏向逆行方向。机制上，Us7/gI-Us8/gE-Us9复合体对于将驱动蛋白马达（包括驱动蛋白-3马达KIF1A）高效招募至反式高尔基体网络新组装的病毒颗粒是必需的，从而促进轴突分选和向突触前末端的顺行运输。因此，这些病毒蛋白的缺失减少了子代病毒粒子的顺行递送，并将传播的表观方向性转向逆行途径。重要的是，这种方向性应被解释为强偏倚而非绝对属性。根据病毒剂量、神经元亚型、注射部位和存活时间，可能发生非偏好方向的残留标记，晚期细胞病变损伤可能进一步增加病毒粒子的非特异性细胞外释放。由于PRV逐步跨越突触传播，病毒传播允许的时间决定了标记的突触步骤数：短时间间隔将标记限制于直接突触前伙伴，而较长间隔使病毒能够到达相继的高阶神经元。这一时间逻辑通过携带两个报告基因的基因定时PRV变体进一步优化，该变体通过表达时序和荧光团成熟差异产生早期绿色和延迟红色信号，颜色组成报告相对感染时间，从而帮助解析连接区域间的突触顺序。基于荧光报告基因的工具箱通过多色彩虹PRV进一步扩展，其中注入不同靶点的光谱不同的重组病毒能够解析上游中心的精细空间组织并区分重叠的逆行通路。使用这种方法，可以解析核团（如蓝斑）的内部精细组织，揭示接收来自不同靶点输入的神经元在其内部的空间排列。HSV-1最初由Ugolini及其同事引入作为逆行跨神经元示踪剂，他们证明了其从外周运动和感觉神经向高阶中枢神经元的突触转移。H129毒株显示强顺行偏倚，从而能够从定义注射部位进行多突触输出通路示踪。H129的顺行偏倚被认为源于优先的轴突分选和驱动蛋白-1依赖的病毒衣壳向轴突末端的运输，从而促进向下游突触后神经元的传播，尽管精确分子基础尚不完全清楚。然而，这种偏好是相对的而非绝对的：H129也可发生时间延迟的逆行传播，尤其是在延长存活时间或使用高病毒滴度时。因此，基于H129的标记应结合实验时间窗进行解释，因为早期标记更可能反映预期的顺行进展，而晚期标记可能包含逆行或非特异性成分。与经典H129示踪的细胞病变和多突触性质一起，这些局限性推动了具有改进的突触顺序、毒性和起始细胞特异性控制的工程化H129衍生系统的开发。
**2.3 病毒多突触示踪剂的应用**
基于α疱疹病毒的逆行示踪已应用于广泛的神经系统。在自主神经科学中，PRV被用于映射内脏器官（包括胃、肾上腺、肾、骨髓、脾、胸腺、卵巢和乳腺）的中枢控制，以及边缘-自主连接的后天组装。在感觉和神经内分泌系统中，PRV揭示了海马环路、含黑视素神经节细胞的视网膜网络、视交叉上核的多突触组织及其与觉醒和奖赏环路的连接，以及松果体细胞-视网膜通路。在运动和呼吸系统应用中，已鉴定出参与体温调节的5-羟色胺能前运动神经元、协调交感-运动反应的脑干环路、呼吸运动神经元控制以及面神经去神经支配后的运动皮层重组。PRV感染也作为研究神经胶质细胞对嗜神经病毒反应的模型，揭示了小胶质细胞P2Y12依赖的招募和吞噬作用可限制病毒在中枢神经系统内的传播。总的来说，这些研究说明了多突触疱疹病毒示踪剂的独特价值：它们不仅识别直接输入或输出，还揭示连接外周靶点、自主和神经内分泌中枢、感觉系统以及运动或呼吸控制网络的多步通路的层级组织。
**3 狂犬病毒的单突触逆行示踪**
**3.1 原理和第一代系统**
单突触逆行示踪的主要概念突破来自从RV基因组中删除G基因——这一修饰使病毒成为传播缺陷型。由此产生的载体RVΔG可进入神经元并表达转基因货物，但无法自行产生新的感染性颗粒。为了进一步将初始感染限制于定义起始群体，用EnvA假型化RVΔG，EnvA仅结合由AAV辅助载体递送至目标群体的TVA。在该系统中，起始神经元首先用编码TVA和RV-G的AAV辅助载体转导。在足够的辅助表达后，引入EnvA-RVΔG；在逆行传播至缺乏辅助细胞来源RV-G的突触前伙伴后，病毒无法进一步传播。尽管此设计操作上将标记限制于第一阶突触前神经元，但“跨突触”传播不应被解释为严格突触专属转移的证明。允许RVΔG进入突触前元件的精确膜事件仍不完全清楚，标记效率可能受突触数量、局部膜邻近性、病毒滴度和细胞类型依赖因子影响。在大多数应用中，TVA和RV-G置于Cre重组酶依赖性FLEX/DIO控制下，因此只有表达Cre的神经元成为起始细胞。最常用的EnvA-RVΔG毒株是SAD-B19ΔG，其易于生产且转基因表达水平高，以及CVS-N2cΔG，其显示出约10-20倍更高的跨突触转移效率和改善的神经元存活能力。然而，第一代狂犬病毒示踪剂仍然具有显著毒性：起始神经元支持完整病毒复制，迅速死亡，而突触前输入神经元通常在病毒基因表达导致细胞死亡前仅存活一到两周，从而限制了其在长期实验中的使用。
**3.2 第二代和第三代狂犬病毒载体**
为解决毒性问题，开发了几代新的单突触RV载体。一种策略，以自失活RV（SiR）为例，通过用PEST结构域修饰病毒核蛋白（N）来降低毒性，该结构域是靶向N进行快速蛋白酶体降解的短氨基酸序列。由于N对病毒转录和复制至关重要，此修饰限制了病毒活性的持续时间，而非允许持续复制及相关细胞毒性。重要的是，SiR中的单突触限制仍由与第一代狂犬病毒系统相同的基于ΔG的逻辑赋予：辅助细胞依赖的RV-G互补仅限于起始细胞，因此尽管短暂的初始病毒活性窗口足以实现重组酶表达和向第一阶突触前伙伴的传播，这些次级感染神经元不表达辅助细胞来源的RV-G，因此无法支持进一步的跨突触传播。在此早期窗口期间，SiR基因组表达位点特异性重组酶——Cre或其功能类似物Flp，允许从共递送的AAV报告构建体中切除转录STOP盒，从而稳定激活报告基因或效应转基因。由于这种重组介导的转基因表达在病毒沉默后持续存在，示踪神经元仍可进行长期解剖和功能分析。然而，后续工作对此策略的实际实施提出了重要关切。Jin及其同事发现，一些SiR制剂中相当一部分病毒颗粒在体外扩增期间（注射前）已经丢失了PEST修饰。这是因为缺乏PEST结构域的变体在包装细胞生产过程中获得选择性优势。这些发现不一定与其他人报道的体内稳定性不一致，因为两项研究解决了系统的不同方面。一种补充方法不仅删除G基因，还删除病毒聚合酶基因L（RVΔGL双缺失突变体）。由于病毒聚合酶是RV所有转录所必需的，其缺失消除了细胞毒性，同时将转基因表达降低至低但功能有用的水平——足以触发报告构建体中的Cre或Flp介导的重组，因为即使痕量的重组酶也能催化不可逆的loxP或FRT位点切除。这些载体最初被表征为无毒逆行示踪剂；后续工作表明，RVΔGL载体在起始细胞中反式提供RV-G和RV-L时支持单突触示踪，超过90%的标记神经元在12周纵向成像期间存活且视觉反应特性未受干扰。最近，第三代ΔL载体——其中仅删除聚合酶基因足以消除毒性——实现了与RVΔGL载体相似的无毒性，同时增长至显著更高的滴度，从而在体内实现更多数量的逆行标记神经元，并使常规大规模示踪更可行。
**3.3 基于狂犬病毒系统的应用**
基于狂犬病毒的单突触示踪已实现对全脑范围内遗传、解剖或投射定义的神经元群体的直接突触前输入进行系统映射。这些方法不仅揭示了哪些神经元向给定起始群体提供输入，而且表明不同细胞类型和投射定义的神经元群体可接收不同模式的长程和局部输入。例如，皮层中间神经元类别的全脑RV示踪显示，表达小清蛋白、生长抑素和VIP的中间神经元接收来自皮层、丘脑和基底前脑区域的重叠但数量上不同的输入集，表明抑制性细胞类别不仅在局部环路角色上不同，而且在其长程输入架构上也不同。投射定义的狂犬病毒策略进一步揭示了腹侧被盖区（VTA）多巴胺能神经元的输入-输出组织。在这些实验中，神经元首先由其下游投射靶点定义，然后使用狂犬病毒单突触示踪鉴定向每个投射定义群体提供输入的直接突触前神经元。该方法表明，投射至不同脑区的VTA神经元接收来自不同上游来源的输入，将其输出靶点与输入组织联系起来。RV示踪还与全脑成像结合，以定义特定神经元群体的全脑输入组织，包括脊髓V1中间神经元及其分子不同亚群的下行输入。类似方法已映射至基底前脑钙视网膜蛋白表达神经元的输入，并将这些环路与气味学习联系起来。
**4 顺行单突触工具**
**4.1 工程化H129衍生的HSV-1系统**
早期H129衍生示踪剂对顺行示踪有效，但表现出多突触传播，限制了其识别直接输出靶点的能力。通过从H129基因组中删除胸苷激酶（TK）基因，并通过Cre依赖的AAV辅助病毒（AAV-TK）反式提供TK，实现了单突触限制的第一步，从而使生产性复制（以及跨突触传播）仅发生在遗传定义的起始细胞群体中。最近，H129扩增子（H129Amp）系统被开发出来，以将示踪剂表达与完整病毒复制周期解耦。在这些系统中，荧光报告基因或功能转基因由HSV-1扩增子携带，该扩增子是最小的HSV衍生DNA载体，包含复制和包装所需的顺式作用序列，但缺乏病毒蛋白编码基因。由于扩增子无法自行产生病毒蛋白，复制和包装功能由起始细胞中共注射的H129衍生辅助病毒反式提供。在一种实现中，该辅助病毒是TK缺陷型并携带floxed包装信号。扩增子表达Cre，切除辅助病毒基因组中的包装信号，阻止辅助病毒进一步衣壳化，并倾向于产生和释放携带报告基因的扩增子颗粒而非辅助病毒粒子。因此，扩增子颗粒可从起始神经元传播至其直接突触后靶点，而辅助病毒持续传播被阻断，从而将标记主要限制在单个顺行突触步骤。此设计保留了强标记，同时改进了传播控制，降低了毒性，并将实验持续时间从数周缩短至数天。因此，H129Amp系统特别适用于从定义起始区域或遗传选择的起始细胞群体鉴定下游突触后靶点。通过实现快速顺行单突触标记并支持与功能环路分析结合，这些方法将输出映射推向实验上可操控的突触后群体。另一种策略使用病毒基因组包装基因ul6的缺失，该基因编码病毒DNA包装所需蛋白，通过AAV的Cre依赖互补将传播限制在一个顺行突触连接。
**4.2 基于AAV的跨突触方法**
AAV在神经元中缺乏任何复制机制，但某些血清型——特别是AAV1和AAV9——在注入突触前区域后可跨越突触。转移似乎依赖于突触囊泡释放而非主动病毒传播，表明AAV颗粒与神经递质共释放并被突触后神经元通过内吞作用摄取。转移是否严格限于活跃突触还是也可通过非突触转胞吞发生——其中颗粒独立于突触活动被动穿过轴突膜——仍不清楚。基于AAV的跨突触标记通常效率较低且严格突触特异性低于RV或疱疹病毒系统，其逆行运输潜力可能使解释复杂化，尤其是在具有交互连接的环路中。
**4.3 合成跨突触系统**
最近，越来越多的工作致力于神经元之间的转移不再由病毒复制本身介导的跨突触方法。作为原理验证，ATLAS（基于抗体样传感器的顺行跨突触标记）证明遗传定义的突触前神经元可通过非复制蛋白基机制标记其突触后伙伴。在该方法中，突触前神经元产生由两个连接部分组成的有效载荷：抗体样结合结构域AMPA.FingR，识别突触后神经元上AMPA受体GluA1亚基的胞外区，以及Cre重组酶。该有效载荷通过突触囊泡胞吐作用从突触前末端释放到突触间隙，结合突触后膜上的GluA1，然后通过内吞作用进入突触后神经元。内化后，Cre到达细胞核并激活floxed报告基因，从而标记突触后细胞。由于有效载荷通过突触囊泡融合释放，ATLAS不依赖病毒复制并提供活性依赖性顺行标记，优先标记标记窗口期间活跃的突触，同时降低与复制病毒示踪剂相关的毒性。一个相关的概念先例是果蝇中的trans-Tango系统，其使用类似的配体-受体策略进行顺行跨突触标记。除了连接性映射本身，这些示踪策略可与互补的解剖、分子、功能和因果读出整合。
**5 条件性起始细胞靶向策略**
**5.1 基于重组酶的系统**
病毒环路示踪方法中的一个核心挑战是确保标记限于预期的起始群体。最广泛使用的解决方案是通过Cre依赖的AAV辅助载体递送TVA和RV-G，以便只有表达Cre重组酶的神经元成为起始细胞；该策略依赖于最初在哺乳动物细胞中建立的位点特异性Cre/loxP重组系统。TVA和RV-G可在单独载体上递送或组合成单个双顺反子构建体，通过2A自切割肽序列连接——如FLEX-TVA-2A-oG——允许通过翻译期间核糖体跳跃从单个mRNA产生两个独立蛋白。由于大量转基因小鼠品系在特定细胞类型中表达Cre，此方法提供了对几乎任何遗传定义的神经元群体的广泛灵活访问。通过交叉策略可实现更高精度，其中两种重组酶——最常用Cre和Flp——通过独立的FLEX和fDIO盒各自控制辅助系统的一个组件，使得完全起始细胞能力要求两者同时活跃。只有共表达Cre和Flp的神经元产生两种辅助组件并成为完全起始细胞；仅表达一种重组酶的神经元仅产生一种组件，无法启动示踪。此设计与单个双顺反子2A构建体不兼容，因为将两个组件置于同一重组酶控制下将消除AND门逻辑；将两个盒包装入单个AAV同样因载体约4.7 kb的货物容量而受阻。交叉系统的AND门特异性完全取决于宿主细胞中驱动Cre和Flp表达的启动子，这些启动子通常是不同的：Cre最常由敲入驱动品系在细胞类型特异性内源性启动子控制下提供，而Flp由与Cre品系杂交的单独驱动品系（产生双转基因动物）或通过携带不同细胞类型或区域特异性启动子的逆行AAV递送——后者避免额外育种的需要。由于两种重组酶因此在独立转录控制下表达，只有同时满足两个分子标准的神经元才成为起始细胞——例如，属于特定细胞类型并位于特定脑区。
**5.2 药理学控制系统**
时间控制可通过诱导型系统添加，该系统将重组酶活性限制在定义时间窗内。四环素调控系统运作如下：在Tet-Off中，四环素控制的反式激活蛋白（tTA）——细菌Tet阻遏物与转录激活结构域的融合——组成型驱动转基因表达，但被强力霉素沉默；而在Tet-On中，反向变体（rtTA）默认无活性，仅在强力霉素结合时开启转录，允许对TVA或RV-G表达的时序和持续时间进行精确药理学控制。这种Tet调控控制也已纳入基于狂犬病毒的辅助AAV构型中，以调节辅助基因表达的时序和水平，为控制示踪效率和毒性提供额外的药理学层。在他莫昔芬依赖的Cre-ER系统中，起始细胞表达融合蛋白，其中Cre重组酶与来自修饰雌激素受体的配体结合域融合，该受体不再响应内源性激素但保留对合成配体他莫昔芬的敏感性。在没有他莫昔芬的情况下，嵌合蛋白通过结合热休克蛋白保留在细胞质中；仅在他莫昔芬给药后，它解离、转位至细胞核并激活重组，从而仅在药物暴露期间赋予起始细胞能力。
**5.3 活性依赖性系统**
活性依赖性策略如TRAP（活跃群体中的靶向重组）增加了进一步维度，其中Cre-ER在即时早期基因启动子（如Fos或Arc，在活跃神经元中快速转录）控制下表达。由于他莫昔芬仅打开一个短暂的时间窗供Cre-ER进入细胞核，Cre介导的floxed STOP盒切除仅发生在该期间活跃的神经元中。这使得在特定刺激、行为或学习事件中涉及的神经元中永久性开启报告基因或辅助基因表达，并随后将它们用作功能定义的起始群体进行环路示踪。在CANE（捕获激活的神经元集群）方法中，AAV载体在活性依赖性启动子控制下递送病毒进入受体（如TVA）。在特定行为经验期间活跃的神经元转录该受体并显示在其表面；随后注射的EnvA假型化病毒因此只能感染该最近活跃的群体，无需转基因动物。
**5.4 投射定义系统**
TRIO（追踪输入与输出关系）用于识别由投射靶点定义的神经元的输入。首先，将逆行载体——rAAV（其中“r”前缀表示其逆行优化衣壳而非AAV的一般方向性），携带强通用启动子驱动Cre重组酶表达（rAAV-Cre）——注入靶区。它被投射至该区域的神经元轴突末梢摄取并逆行运输至其胞体；一旦进入胞体，AAV基因组被转录，产生Cre蛋白，随后进入细胞核并变得活跃，从而使这些投射神经元表达Cre，无需载体跨越突触。接着，将两个AAV辅助载体注入含有这些投射神经元的脑区：一个携带Cre依赖的FLEX-TVA-mCherry盒，另一个携带Cre依赖的FLEX-RV-G盒。在接受rAAV因此表达Cre的投射神经元中，重组酶将两个转基因均反转至正义方向，激活TVA-mCherry和RV-G表达。然后，将EnvA-RVΔG-GFP注入同一区域，结合起始细胞胞体和树突上的TVA-mCherry并进入。由于EnvA-RVΔG-GFP在其基因组中携带GFP，它在进入的每个神经元中表达GFP——包括起始细胞和逆行传播后的突触前输入伙伴。起始细胞因此携带两种荧光信号：红色来自膜结合的TVA-mCherry，绿色来自病毒表达的GFP，合并时呈现黄色信号。突触前输入神经元，逆行接收EnvA-RVΔG-GFP但从未被AAV辅助载体转导，因此既不表达TVA-mCherry也不表达RV-G，仅呈绿色。由于那些伙伴缺乏RV-G，进一步的跨突触传播被阻断。在条件性TRIO（cTRIO）中，AAV盒与TRIO中使用的相同，唯一区别是逆行载体携带Flp依赖的构建体（rAAV-fDIO-Cre）而非组成型表达的Cre。这意味着Cre仅在逆行标记的神经元中产生，如果该神经元本身表达Flp——由转基因Flp驱动品系赋予，其中Flp在细胞类型特异性内源性启动子下表达。在这种情况下，Cre仅在既投射至靶区又在其基因组中在细胞类型特异性启动子下编码Flp的神经元中表达，通常标记特定细胞类型。这种双重要求将起始群体限制为同时由投射靶点和分子身份定义的神经元。总之，这些方法允许病毒示踪不仅针对分子定义的细胞类型，还针对由近期活性、投射靶点或这些特征组合定义的神经元。这些策略形成了从简单Cre依赖靶向到交叉、活性定义和投射定义起始细胞选择的层级递增限制。
**6 病毒示踪的空间和转录组读出**
**6.1 分子条形码和转录组整合**
标准RV示踪用相同荧光标记物标记所有输入神经元，使得无法确定哪个输入连接到哪个单个起始神经元。分子条形码通过将独特短核苷酸序列纳入每个病毒颗粒来应对，因此每个起始神经元及其突触前伙伴携带可通过测序读取的不同标签，从而能够同时跨多个起始神经元以单细胞分辨率映射连接性。关键挑战是确保条形码文库足够大且均匀，以便每个起始神经元获得唯一标签；最近的优化改进了文库多样性和均匀性，同时降低了背景污染，使单个实验中可靠标记大量起始神经元成为可能。转录组方法为这些病毒示踪环路提供互补分子读出。将条形码RV与单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合——其中解离细胞被单独分析全基因组基因表达——使得确定哪些转录组细胞类型被连接并分析连接性与基因表达的关系成为可能。这种方法，以SBARRO方法为例，表明可在单个实验中推断突触伙伴关系，同时捕获全基因组转录组。虽然强大，但scRNA-seq需要组织解离，因此移除原生空间背景。原位测序方法通过直接在组织切片中读取病毒条形码和内源转录本来应对，从而保留空间背景。BARseq是此类方法之一，结合原位条形码测序与选定标记基因面板的检测。BARseq最初开发用于非病毒条形码神经元的投射映射，后来适应于条形码RV，允许将跨突触输入关系与分子细胞身份联系起来，同时保留组织切片中的空间信息。互补方法如MAPseq从解剖靶区高通量回收条形码，但牺牲空间信息。总之，这些方法识别连接神经元群体的细胞类型、空间分布、标记基因、通路和潜在环路组织。
**6.2 全脑成像**
现代病毒示踪越来越多地与全脑成像方法结合，使得能够检查整个大脑而非有限组织切片中的标记环路。组织透明化方法如CLARITY和iDISCO通过去除脂质同时保留荧光信号和蛋白质结构使大脑透明，允许在完整组织深处可视化荧光标记的神经元和轴突。这些透明大脑随后可通过光片荧光显微镜进行三维成像，该显微镜一次仅照亮薄组织平面，从而在大体积内实现高成像速度且最小光漂白。当所得图像通过计算与参考脑图谱对齐时，标记细胞和投射可被分配至定义解剖区域并以标准化方式跨全脑量化。病毒示踪与组织透明化和图谱配准的结合对于从定义起始群体生成全脑输入图以及比较跨实验条件或基因型的连接模式特别强大。避免透明化技术要求的另一种方法是使用自动幻灯片扫描的基于连续切片的3D重建。当完整切片系列被数字化并配准至参考图谱时，标记投射可以以与透明化方法相当的解剖保真度进行映射，同时保留与常规免疫荧光协议的完全兼容性并避免深度依赖的抗体穿透伪影。
**7 从解剖学到功能：整合性病毒环路分析**
**7.1 功能读出：钙成像和电压成像**
除了识别哪些神经元被连接，病毒示踪可与遗传编码的活性指示剂结合，以确定这些环路何时以及如何被激活。早期原理验证研究表明，功能报告基因可直接整合入嗜神经示踪剂基因组，包括表达遗传编码钙指示剂
