复制偶联双脱氨酶突变技术（RCDM）能够实现枯草芽孢杆菌的持续基因组进化

《Microbial Cell Factories》：Replication-coupled dual-deaminase mutagenesis (RCDM) enables continuous genomic evolution in Bacillus subtilis

　　

摘要

枯草芽孢杆菌是一种被广泛认为安全且可用于工业酶生产的重要微生物底盘，然而仅依靠理性工程手段来系统改善其复杂的表型特征——如蛋白质分泌能力——仍然十分困难。连续进化策略提供了一种有效的替代方案，但在枯草芽孢杆菌中的应用还比较有限，这主要是因为该菌具有高效的DNA修复系统，能够抑制突变中间体的产生。在此，我们介绍了一种与复制过程相结合的双脱氨酶突变平台（RCDM），该平台能够实现枯草芽孢杆菌基因组的高效、连续多样化。在该系统中，互补的胞嘧啶脱氨酶和腺嘌呤脱氨酶被连接到解旋酶装载因子DnaB上，从而可以作用于复制过程中产生的单链DNA。通过系统的结构优化，我们发现突变活性存在明显的拓扑结构依赖性：胞嘧啶脱氨需要与蛋白的C端融合，而腺嘌呤脱氨则在与DnaB的N端融合时效率最高。重要的是，我们发现宿主细胞的DNA修复机制会显著影响突变结果：Ung酶能够去除尿嘧啶，从而有效掩盖双脱氨酶构象中由胞嘧啶引发的突变。共同表达尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂Ugi可以缓解这种修复限制，使C:G→T:A和A:T→G:C的突变比例保持平衡，从而使整个基因组的突变频率达到(2.80?±?0.10) × 10??。为了验证这一平台的实用性，我们将α-淀粉酶的分泌功能与在可溶性淀粉上的生长过程相结合，进行了与生长过程同步的连续进化实验。经过20次迭代筛选后，进化后的菌群其细胞外α-淀粉酶的活性相比初始菌株提升了约30倍。综上所述，我们建立了一个以复制过程为靶点且能考虑DNA修复机制的枯草芽孢杆菌连续进化平台，这一平台为快速优化复杂的微生物表型提供了有效的策略，同时也丰富了用于工业革兰氏阳性微生物的连续进化技术手段。