通过GFP引导的富集技术实现ASC来源猪肺类器官的高效基因组编辑

《Stem Cell Research & Therapy》：Efficient genome editing in ASC-derived porcine lung organoids via GFP-guided enrichment

　　

摘要

背景

由于具有组织特异性，成体干细胞衍生的类器官是疾病建模和转化医学中极为重要的工具。然而，其复杂的三维结构以及较低的基因组编辑效率，给功能遗传学研究带来了很大挑战。为克服这些限制，本研究旨在建立猪肺类器官，并利用猪与人类在生理和解剖结构上的高度相似性，开发一种高效且稳定的基因组编辑平台。

方法

猪肺类器官是从肺组织中提取的，通过免疫荧光和免疫组化分析对其特性进行检测。为提高CRISPR/Cas9和Prime编辑技术的基因组编辑效率，采用了GFP引导的富集策略，即同时靶向GFP转基因和内源基因位点，随后筛选出GFP阴性的类器官。通过单个体器官的克隆扩增，得到遗传上高度同质的细胞系。基因修饰效果通过cDNA测序和西方印迹分析进行验证。结构完整性则通过AlphaFold2模型进行评估，而功能变化则通过福斯可林诱导的肿胀试验来检测。

结果

所建立的猪肺类器官具有持续的自更新能力，能表达表面活性蛋白C以及近端上皮细胞和间充质细胞的标记物，体现出复合型肺类器官的特征。GFP引导的富集策略显著提高了编辑细胞的比率；GFP阴性组的突变率明显高于GFP阳性组。该系统成功生成了遗传上高度同质的全基因编辑克隆，即便使用Prime编辑等复杂技术，也能有效筛选出经过精确编辑的类器官。

结论

本研究开发的猪肺类器官及基因组编辑平台为转化医学提供了强大的工具。该系统能够在高度模拟人类肺生理功能的模型中进行精准的基因操作，为重现人类肺部疾病、研究人畜共患传染病以及验证基因疗法的有效性提供了重要平台。