血管TMEM16A缺失损害脑血流自动调节并加重缺血再灌注损伤

《Translational Stroke Research》：Loss of Vascular TMEM16A Impairs Cerebral Autoregulation and Exacerbates Ischemia–reperfusion Injury

　　

TMEM16A在血管壁细胞（平滑肌细胞和周细胞）中形成Ca2?激活的Cl?通道（Ca2?-activated Cl? channel），该通道在细胞内Ca2?升高时产生去极化Cl?外流，从而增强激动剂诱导的血管收缩。TMEM16A已被认为与脑缺血后毛细血管周细胞过度收缩有关，提示其抑制可能改善卒中后恢复。然而，系统性血管TMEM16A抑制对局灶性再灌注效率及脑血管自动调节的影响仍未知。为解答此问题，研究人员对具有诱导性壁细胞特异性（由肌球蛋白重链11启动子控制）TMEM16A缺失的小鼠进行短暂性大脑中动脉闭塞（transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO）。通过激光散斑对比成像（laser speckle contrast imaging, LSCI）评估再灌注动态及卒中再灌注结局，采用圆柱体测试（cylinder test）评估运动功能，并通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色定量梗死灶。使用无线电遥测技术（radiotelemetry）监测系统性心血管参数。通过压力肌电图（pressure myography）评估大脑中动脉肌源性张力。与野生型对照相比，壁细胞缺失TMEM16A的小鼠再灌注受损且卒中结局恶化，尽管系统性心血管参数未改变。在野生型小鼠中，毛细血管周细胞在双侧半球维持基础收缩张力，且其在梗死灶周围皮层进一步增强。相反，TMEM16A缺陷的毛细血管周细胞在患侧和对侧半球均缺乏基础张力。TMEM16A缺陷的大脑中动脉无法产生压力诱导的肌源性张力。这些发现表明，TMEM16A是有效脑血流自动调节所必需的，其缺失显著损害缺血后再灌注。该结果警示，将系统性TMEM16A抑制作为卒中治疗策略可能有害，并强调需采用空间限制性方法通过Ca2?激活的Cl?通道调节脑灌注。

**论文解读：血管TMEM16A缺失损害脑血流自动调节并加重缺血再灌注损伤**

**研究背景与问题**
脑血流自动调节（cerebral autoregulation）是维持脑组织稳定灌注的关键机制，依赖于血管壁细胞（包括平滑肌细胞和周细胞）的收缩与舒张能力。TMEM16A是一种Ca2?激活的Cl?通道（Ca2?-activated Cl? channel, CaCC），在血管壁细胞中表达，当细胞内Ca2?升高时，该通道介导Cl?外流，引起膜去极化，进而增强电压门控Ca2?内流，放大激动剂诱导的血管收缩。以往研究提示，TMEM16A在脑缺血后参与毛细血管周细胞的过度收缩，导致再灌注障碍，因此其抑制被认为可能改善卒中后恢复。然而，这些结论主要基于非特异性药理学抑制剂的应用，且TMEM16A在脑内广泛表达于多种细胞类型（包括上皮细胞、胶质细胞、脑血管平滑肌细胞、内皮细胞、周细胞和神经元），使得区分血管与非血管效应极为困难。此外，系统性TMEM16A抑制对局灶性再灌注效率及脑血管自动调节的整体影响尚不清楚。因此，本研究旨在通过建立壁细胞特异性TMEM16A基因敲除小鼠模型，明确TMEM16A在脑血流自动调节和卒中再灌注损伤中的确切作用。

**研究内容与结论**
研究人员利用他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统，在平滑肌肌球蛋白重链11（Myh11）启动子控制下，特异性敲除小鼠血管壁细胞（平滑肌细胞和周细胞）中的TMEM16A基因（TMEM16A SM-KO），并以仅表达Cre重组酶的小鼠作为野生型（WT）对照。通过短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）模型诱导局灶性脑缺血，随后评估再灌注动力学、梗死体积、运动功能及系统性心血管参数。研究发现：TMEM16A SM-KO小鼠在缺血后表现出更严重的灌注下降、再灌注延迟、梗死体积增大以及运动功能损害，而系统性血压、心率等心血管参数与WT小鼠无差异。进一步机制研究表明，TMEM16A缺失导致毛细血管周细胞基础收缩张力丧失，大脑中动脉无法产生压力诱导的肌源性张力，提示脑血流自动调节功能严重受损。蛋白质组学分析显示，TMEM16A SM-KO小鼠缺血侧皮层多条信号通路（如α-肾上腺素能、血清素能、内皮素、胰岛素受体酪氨酸激酶及谷氨酸能信号）显著抑制，并伴有炎症和凋亡通路激活，而WT小鼠的缺血诱导变化相对温和。这些发现表明，TMEM16A是维持脑血流自动调节的关键分子，其缺失会破坏再灌注效率，加重缺血性损伤。该研究发表在《Translational Stroke Research》，警示系统性TMEM16A抑制作为卒中治疗策略可能带来不良后果，并强调需采用局部干预手段（如导管递送药物）来调节脑灌注。

**主要关键技术方法**
1. **基因敲除小鼠模型**：采用他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统，在平滑肌肌球蛋白重链11（Myh11）启动子控制下，特异性敲除血管壁细胞（平滑肌细胞和周细胞）中TMEM16A基因（TMEM16A SM-KO），WT对照为仅表达Cre重组酶的小鼠（来源：丹麦动物实验监察机构批准，雄性小鼠，2-5月龄）。
2. **脑缺血模型与血流成像**：通过短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAO）诱导局灶性脑缺血（机械闭塞1小时，再灌注24小时），利用激光散斑对比成像（LSCI）实时监测基线、闭塞期、再灌注即刻及24小时后的脑血流指数（BFI），并评估不同血管分支及实质区血流变化。
3. **行为学评估**：采用圆柱体测试（cylinder test）在基线及再灌注24小时后评估运动功能（移动距离、速度、直立、理毛及前爪不对称性）。
4. **组织学与免疫荧光**：通过TTC染色定量梗死体积，免疫荧光标记PDGFRβ（周细胞）和凝集素（毛细血管），测量毛细血管直径及周细胞相关收缩状态。
5. **压力肌电图**：分离大脑中动脉，在40-120 mmHg压力梯度下测量外径，计算肌源性张力。
6. **蛋白质组学**：采用串联质量标签（TMT）定量蛋白质组学结合反相纳米液相色谱-串联质谱（nano-LC-MS/MS）分析缺血侧和对侧皮层差异表达蛋白，并使用Ingenuity Pathway Analysis进行通路分析。
7. **无线电遥测**：植入遥测探头（Data Sciences International）连续监测清醒自由活动小鼠的血压、心率及活动度。

**研究结果**
**1. 成功构建平滑肌细胞特异性TMEM16A敲除小鼠**
Western blot证实，TMEM16A SM-KO小鼠主动脉和大脑中动脉中TMEM16A蛋白表达显著降低，心脏组织无差异。全细胞膜片钳记录显示，WT小鼠大脑中动脉平滑肌细胞中存在Ani9（TMEM16A抑制剂）敏感的Ca2?激活Cl?电流，而TMEM16A SM-KO小鼠中该电流几乎为零。免疫组化进一步证实，TMEM16A在WT小鼠α-平滑肌肌动蛋白阳性周细胞和动脉平滑肌细胞中表达，在TMEM16A SM-KO小鼠中缺失。

**2. TMEM16A缺失加剧缺血后脑灌注障碍**
LSCI显示，在MCA闭塞期间，TMEM16A SM-KO小鼠大脑中动脉主干、分支、实质及引流静脉的BFI下降幅度显著大于WT小鼠；再灌注即刻，TMEM16A SM-KO小鼠灌注恢复明显延迟；24小时后两组灌注基本恢复。此外，对侧前脑动脉的BFI在缺血期间也下降，且TMEM16A SM-KO小鼠下降更显著。缺血侧半球内BFI降低超过75%（闭塞期）和80%（再灌注初期）的区域面积在TMEM16A SM-KO小鼠中更大。

**3. 梗死体积增大及运动功能恶化**
TTC染色显示，TMEM16A SM-KO小鼠再灌注24小时后梗死核心体积显著大于WT小鼠，水肿无差异。圆柱体测试表明，TMEM16A SM-KO小鼠基线时即表现出移动距离、速度和直立次数减少，缺血再灌注后这些指标进一步恶化，且理毛行为增加。前爪不对称性无差异。相关性分析提示，动脉BFI与部分运动参数存在弱相关。

**4. 系统性心血管参数无差异**
无线电遥测显示，WT和TMEM16A SM-KO小鼠的平均动脉压、心率及昼夜节律无差异，但TMEM16A SM-KO小鼠自主活动度较低。异氟烷麻醉对心血管参数的抑制效应在两组间一致。

**5. 毛细血管形态及周细胞收缩状态改变**
免疫荧光分析显示，两组小鼠毛细血管密度和孔隙率在缺血侧和对侧皮层无差异，但周细胞相关毛细血管直径在WT小鼠缺血侧显著减小（收缩），而TMEM16A SM-KO小鼠缺血侧周细胞相关毛细血管直径较WT小鼠显著增大（松弛），提示TMEM16A缺失导致周细胞基础收缩张力丧失。

**6. 大脑中动脉肌源性张力减弱**
压力肌电图显示，在80 mmHg压力下，TMEM16A SM-KO小鼠大脑中动脉的肌源性张力显著低于WT小鼠，表明其自动调节能力受损。

**7. 蛋白质组学揭示广泛信号通路改变**
共鉴定5160个蛋白质。与WT相比，TMEM16A SM-KO小鼠对侧皮层中350个蛋白差异表达，涉及炎症、突触传递和离子转运通路激活；缺血侧皮层中343个蛋白差异表达，涉及炎症、凋亡和应激反应增强，而平滑肌收缩相关通路（如α-肾上腺素能信号）抑制。组内比较显示，WT小鼠缺血侧仅214个蛋白差异表达，而TMEM16A SM-KO小鼠有572个，且多条通路（如α-肾上腺素能、血清素能、内皮素、线粒体功能等）显著抑制，同时伴有YAP1和SRSF1活性降低，提示细胞运动和代谢状态改变。

**讨论与结论**
本研究表明，TMEM16A缺失并未改善卒中结局，反而显著加重了缺血再灌注损伤，这与先前基于药理学抑制的假设相反。研究人员认为，TMEM16A对于维持脑血流自动调节至关重要，其缺失导致血管壁细胞（尤其是周细胞）无法产生基础收缩张力，进而削弱了缺血后血液重新分布的能力，使得更多血流被“窃取”至非缺血区域，加剧了缺血核心的灌注不足。这一机制得到以下证据支持：TMEM16A SM-KO小鼠大脑中动脉肌源性张力减弱、周细胞相关毛细血管松弛、对侧前脑动脉灌注下降以及蛋白质组学中多条收缩相关通路抑制。尽管存在麻醉和蛋白质组学混杂因素，但系统性心血管参数稳定、基因敲除高度特异性，有力地支持了研究结论。

**研究结论翻译**：总之，壁细胞中TMEM16A介导的Ca2?激活Cl?电导缺失会加重卒中结局，这很可能归因于脑循环自动调节功能受损。由此导致的脑血管张力丧失损害了脑血流自动调节，降低了再灌注期间血流重新分布的效率和毛细血管血流均一性。这些发现将TMEM16A确定为卒中恢复的关键决定因素，并提示：虽然局部抑制TMEM16A活性可能缓解梗死周围血管痉挛，但全身性或系统性抑制可能带来不良后果。