《Journal of Chromatography B》：A versatile reversed-phase liquid chromatography charged aerosol detection method for streamlined monitoring of QS-21 content and stability in liposomal adjuvant formulations
编辑推荐：
•针对脂质体制剂中的QS-21佐剂，研究团队开发出一种高效的UHPLC-CAD分析方法。•该UHPLC-CAD方法被用于定量并分析包含AS01B在内的脂质体制剂中的QS-21含量。•通过计算机模拟色谱建模技术，加快了方法开发进程，便于后续质量控制应用。•采用苯基己基固定相来分离Q
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针对脂质体制剂中的QS-21佐剂，研究团队开发出一种高效的UHPLC-CAD分析方法。
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该UHPLC-CAD方法被用于定量并分析包含AS01B在内的脂质体制剂中的QS-21含量。
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通过计算机模拟色谱建模技术，加快了方法开发进程，便于后续质量控制应用。
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采用苯基己基固定相来分离QS-21成分。
引言
科学与医学的进步催生了众多新的药物和疫苗，能够满足临床上的未满足需求。在过去的一个世纪里，疫苗作为安全有效的预防工具，被用于预防各种传染性疾病和致命疾病。疫苗通过激活体液免疫系统和适应性免疫系统，产生针对特定抗原的保护性抗体和免疫细胞来发挥作用。疫苗由抗原、佐剂以及无活性的配方成分组成，其中佐剂是能够刺激并增强免疫反应的物质。佐剂种类繁多，包括小分子、乳剂、铝盐、聚合物、脂质体以及皂苷等[1]。其中研究较为广泛的佐剂之一就是从智利特有植物Quillaja Saponaria Molina的树皮提取物中分离得到的皂苷——QS-21[2]。QS-21是一种糖基化三萜类化合物，与复杂的糖基化18碳酰基链结合在一起，其结构如图1a所示[3]。它是一种强效的免疫刺激剂，能够引发Th1和Th2类型的免疫反应[4]。不过，以游离状态存在的QS-21具有剂量依赖性的毒性，并且还具有较强的溶血作用。虽然将其包裹在脂质体中可以消除这种毒性，但目前仍有许多研究致力于合成同样有效但毒性更低的QS-21类似物[5]、[6]、[7]。目前，QS-21被制成多种商用佐剂，如AS01B、AS01E和ISCOMATRIX等。这些佐剂已被用于针对带状疱疹、HPV和疟疾等多种疾病疫苗的研发，而含有QS-21的军用脂质体制剂（ALFQ）则被用于COVID-19和HIV-1的相关临床研究[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。
准确测定疫苗制剂中QS-21的含量及其稳定性，对于工艺开发、剂量确定、保障患者安全以及监测产品稳定性而言至关重要。在含抗原的制剂中，QS-21通常被包裹在脂质体中，但其在水基制剂中的稳定性较差[13]、[14]。疫苗通常在接近生理pH值（约7.4）的水基介质中制备。在这种环境下，QS-21会因pH值的变化而发生降解，失去酰基链，生成QS-21水解产物（QS-21 HP），如图1b所示。这类降解产物会降低Th1免疫反应的效力，同时也会减弱其作为佐剂的活性[3]、[15]、[16]。从安全性角度来看，游离状态的QS-21或从脂质体中释放出来的QS-21，在低浓度下就可能导致反应原性反应以及红细胞的溶血现象[15]。同样，QS-21 HP也会引发溶血反应，但其作用强度约为完整QS-21的1/10[15]。因此，有必要同时测定疫苗制剂中完整的QS-21及其降解产物QS-21 HP的含量。为此，需要一种稳定性的检测方法，以支持产品的临床研发和商业化应用。根据FDA的药物稳定性指南，“用于稳定性研究的分析方法应当具备足够的特异性，能够区分未被改变的药物和可能的降解产物，同时还需保证方法的准确性和精密度。”
由于QS-21具有复杂的物理化学性质，为其开发分析方法并非易事。例如，QS-21的异构体如QS-21A和QS-21B，它们的区别仅在于酰基链在岩藻糖环上的位置，这类异构体天然存在于提取物中，而纯化过程也可能导致它们之间的转化。此外，如果去除末端的花青糖或木糖，还会生成QS-21 R1和R2两种衍生物，如图1a所示。另一个影响QS-21检测的难题是其紫外吸收率较低，因此常规的紫外检测方法难以灵敏地检测出疫苗制剂中低浓度的QS-21、其异构体以及降解产物。液相色谱法结合多种检测技术，已成为检测药物成分及其产品释放情况和稳定性的行业标准，该方法能够实现异构体的分离，也能检测低浓度的分析物。随着直径小于2微米的融合核心颗粒的出现，再加上最高压力可达1300巴的超高效液相色谱技术，显著提升了色谱分离的效率。此前，LC-UV、LC-CAD和LC-MS/MS等方法已被用于检测疫苗佐剂制剂中的QS-21含量并对其进行定性分析[17]、[18]。最近，Abucayon等人证明了LC-MS/MS技术在检测ALFQ制剂中的QS-21时具有较高的灵敏度和选择性[17]。不过，这种基于四极杆轨道阱高分辨率质谱仪的LC-MS/MS技术，在许多合同研究组织和合同生产组织的质量控制环节中，仍不太常用，多用于产品上市前的稳定性检测。相比之下，带电气溶胶检测技术由于其通用性、能够检测那些缺乏发色团且蒸气压较低的分析物，以及较高的灵敏度，在制药行业中越来越普及[19]。该技术的灵敏度、易用性以及在质量控制实验室中的易获取性，使得选择它作为方法开发工具成为一种便捷的选择。
当使用像CAD这样的通用检测器时，色谱技术的重要性更为凸显。如果有任何与分析物一同洗脱的分子存在，都可能导致检测结果出现误差。这进一步强调了色谱分离的重要性，只有确保方法具有选择性、准确性以及稳定性，才能获得可靠的结果。尽管液相色谱技术取得了诸多进展，但针对多组分混合物开发并优化液相色谱分离方法仍然是一项耗时耗力的工作，主要是因为要精确调控方法的选型性和分离效率十分困难。为了解决这些问题，基于软件的离线模拟技术逐渐成为制药行业的常用工具，它不仅有助于提升分析结果的可靠性，还能简化方法验证和转移流程[20]、[21]。方法的选型性受分析物、色谱柱以及流动相的化学性质影响，其中色谱柱的化学性质对复杂药物混合物的有效分离尤为关键。C8、C4和C18等反相色谱柱已被证明可以有效保留和分离QS-21。不过，这类色谱柱可能无法提供额外的相互作用，比如π-π堆叠作用，而这类作用对于分离疫苗制剂中其他含有π键的疏水物质来说可能非常重要[22]、[23]。此外，C18色谱柱也不太适合处理某些高度疏水的脂质体成分，比如单磷酸脂质A（MPLA），因为这类成分会与疏水性固定相产生非常强的结合力[24]、[25]。因此，理想的色谱柱不仅要具备独特的选择性，还要能够让极疏水的分析物顺利洗脱出来。
在本研究中，我们采用反相液相色谱-带电气溶胶检测技术，开发出一种高效、选择性强且适用于方法验证的色谱分析方法，用于测定佐剂制剂中QS-21的含量及其稳定性。据我们所知，目前文献中还不存在采用CAD技术和苯基己基固定相，用于分析脂质体制剂中QS-21及其降解产物的液相色谱方法。我们通过使用直径为2.7微米的苯基己基化学结构的融合核心颗粒，并结合计算机模拟优化，最终确定了稳定的分析条件。该分析方法已在内部佐剂制剂以及商业化的AS01B制剂上得到了验证。
章节要点
液相色谱法
最初的 方法开发以及计算机模拟优化工作是在Agilent 1290 Infinity II色谱仪上完成的（该仪器由美国加利福尼亚州圣克拉拉市的Agilent Technologies公司生产）。这台仪器配备了自动进样器（型号G4226A）、四元泵（型号G4204A）、恒温色谱柱箱（型号G1316C）、色谱柱切换阀（型号5067–4273），以及用于色谱柱和流动相筛选的阀门驱动装置（型号G1170A）。此外，该仪器还配备了带有600纳升流池的二极管阵列检测器模块。
结果与讨论
本研究共有三个主要目标：首先，筛选出能够有效分离QS-21、其异构体以及水解产物QS-21 HP的色谱柱，同时确保所用系统的操作压力处于质量控制领域常用的范围内，即HPLC系统的压力低于600巴，而UHPLC系统的压力可达到1300巴；其次，通过计算机模拟工具优化分析方法，以此替代传统的试错法，提高工作效率；第三，在质量控制实验室中对所开发的方法进行验证。
结论
借助融合核心结构的苯基己基颗粒以及计算机模拟优化技术，我们成功开发出一种高效且稳定的反相液相色谱-带电气溶胶检测分析方法，可用于检测佐剂成分QS-21。通过计算机模拟对色谱条件进行了优化，从而实现了对QS-21 A和QS-21 B及其主要降解产物QS-21 HP的有效分离。实验结果也证实了计算机模拟预测的色谱条件的合理性。此外，我们还进一步优化了样品前处理流程，以减少样品在分析过程中的异构化和水解现象。
作者贡献说明
Caleb Kinsey：负责文本的审阅与编辑、初稿撰写、正式分析、数据整理以及概念构思工作。Rodell C. Barrientos：参与文本的审阅与编辑、初稿撰写、方法设计、正式分析、数据整理以及概念构思工作。Mayank Bhavsar：负责文本的审阅与编辑、正式分析以及数据整理工作。Heather Wang：参与文本的审阅与编辑、实验研究、正式分析以及数据整理工作。Malini Mukherjee：负责文本的审阅与编辑、项目监督以及资源协调工作。
利益冲突声明
所有作者均声明，自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
本项研究完全由美国新泽西州拉韦市的Merck & Co., Inc.旗下的Merck Sharp & Dohme LLC公司提供资金支持。我们还要感谢美国宾夕法尼亚州西点市的Merck & Co., Inc.疫苗药品研发团队提供的佐剂样本。同时，我们也十分感激Devin M. Makey博士和Adam T. Sutton博士对本文稿提出的宝贵修改意见。
Caleb Kinsey|Rodell C. Barrientos|Mayank Bhavsar|Heather Wang|Malini Mukherjee|Emmanuel Appiah-Amponsah|Erik L. Regalado
