TFEB下调与自噬缺陷在衰老肾脏对脓毒症急性肾损伤易感性中的作用

《Aging Cell》：Down-Regulation of TFEB With Defective Autophagy in the Susceptibility of Aging Kidneys to Septic Acute Kidney Injury

　　

脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）是一种常见且破坏性疾病，在老年患者中具有显著更高的发病率和严重程度，但老年SA-AKI的分子基础尚不清楚。近期研究已证明自噬是抗AKI的内在保护机制；然而，自噬在衰老肾脏中的作用和调控仍不明确。在此，研究人员证明衰老肾脏中自噬激活缺陷是其对SA-AKI易感性的关键。在实验中，小鼠衰老肾脏对SA-AKI反应的自噬激活能力受损。在体外，使用TAT-Beclin-1肽激活自噬可减轻脂多糖（LPS）诱导的衰老肾近端小管细胞凋亡和炎症。单细胞测序揭示脓毒症AKI中自噬相关基因（包括TFEB）随年龄显著变化。TFEB过表达可部分恢复衰老肾小管细胞的自噬活性，并保护其免受LPS诱导的损伤。此外，在体内，姜黄素类似物C1（一种TFEB激活剂）治疗增强了衰老肾脏的自噬功能，并减轻了LPS诱导的AKI。这些结果表明衰老肾脏中自噬激活缺陷，这导致老年人对SA-AKI的敏感性和易感性，提示通过增强自噬的治疗策略。

衰老是急性肾损伤（AKI）的独立危险因素，老年患者中脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的发病率和严重程度显著升高，但其分子机制尚不明确。自噬被证实为抗AKI的内在保护机制，但衰老肾脏中自噬的调控及作用仍不清楚。转录因子EB（TFEB）是自噬和溶酶体生物发生的关键调控因子，在多种AKI中发挥作用，然而其在衰老肾脏AKI易感性中的角色未知。因此，本研究旨在探讨衰老肾脏在脓毒症诱导的AKI中自噬年龄相关变化，并进一步证明自噬缺陷在衰老肾脏AKI易感性中的关键作用，揭示TFEB是导致自噬缺陷的关键因素。

研究人员利用年轻（2月龄）和年老（18月龄）C57BL/6小鼠腹腔注射脂多糖（LPS）建立SA-AKI模型，并采用D-半乳糖诱导BUMPT细胞（Boston University小鼠近端肾小管细胞系）衰老模型，分离原代肾小管上皮细胞（mPTECs）进行体外实验。通过单细胞核测序（snRNA-seq）分析肾皮质样本中自噬相关基因表达变化；使用TAT-Beclin-1肽和氯喹（CQ）进行自噬调控；通过TFEB过表达质粒转染和姜黄素类似物C1（TFEB激活剂）进行功能验证；采用免疫印迹、免疫荧光、qRT-PCR、组织学染色（PAS）、血清肌酐和血尿素氮（BUN）测定、TUNEL凋亡检测、SA-β-gal衰老染色等方法评估自噬活性、凋亡、炎症和肾功能。该研究发表在《Aging Cell》。

**2.1 衰老小鼠在LPS暴露后出现比年轻小鼠更严重的AKI**
通过测定血清肌酐和BUN水平，结合PAS染色、免疫印迹检测cleaved caspase-3（c-CAS3）及TUNEL染色，发现LPS处理后衰老小鼠肾脏功能下降更显著、结构损伤更严重、凋亡水平更高。免疫组化检测F4/80（巨噬细胞标志物）及qRT-PCR分析炎症因子（Il-6、Mcp-1、Tnfα）表达，证实衰老肾脏炎症反应更为加剧。

**2.2 LPS诱导的自噬激活在衰老肾脏和衰老肾小管细胞中较低**
免疫印迹和LC3免疫荧光显示，LPS处理后年轻小鼠肾脏LC3-II显著增加，而衰老小鼠肾脏中LC3-II增加幅度明显较小。使用RFP-GFP-LC3质粒转染BUMPT细胞，发现D-半乳糖诱导的衰老细胞在LPS刺激后自噬流率降低。原代肾小管细胞中，衰老细胞LPS诱导的LC3-II表达几乎缺失，且p62（sequestosome 1）积累增加。巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1）处理显示，衰老细胞中自噬流受损，而非自噬活性增强。

**2.3 自噬调控衰老BUMPT细胞对LPS诱导损伤的敏感性**
使用TAT-Beclin-1肽（自噬激活剂）处理衰老BUMPT细胞，显著降低LPS诱导的c-CAS3表达和凋亡，并减轻炎症反应；而氯喹（CQ，自噬抑制剂）则加重凋亡和炎症。进一步研究发现，CQ抑制自噬后，衰老标志物（p16、p21、p53）表达升高，SA-β-gal阳性率增加，细胞活力下降，且未改善LPS诱导的损伤，表明自噬抑制加剧衰老相关表型。

**2.4 snRNA-seq揭示年轻和年老小鼠肾脏LPS处理后自噬基因差异表达**
对年轻和年老小鼠肾皮质进行snRNA-seq，通过UMAP聚类和基因集富集分析（GSEA），发现衰老肾脏中自噬相关通路显著下调。比较差异表达基因，鉴定出包括TFEB在内的多个自噬相关基因在衰老后变化显著。

**2.5 转录因子TFEB在衰老肾小管上皮细胞中LPS诱导后表达下降更显著**
免疫印迹和免疫荧光显示，LPS处理后衰老肾脏中TFEB蛋白水平及磷酸化TFEB（Ser142）水平降低，且TFEB核定位减少。qRT-PCR证实衰老肾脏中Tfeb mRNA在LPS处理后下降，而年轻肾脏无明显变化。体外BUMPT细胞中，D-半乳糖诱导的衰老细胞在LPS处理后TFEB表达下降更为显著，尤其是核内水平。

**2.6 TFEB过表达部分恢复衰老BUMPT细胞的自噬活性**
在D-半乳糖诱导的衰老BUMPT细胞中过表达TFEB，免疫印迹显示LC3-II水平升高，c-CAS3和磷酸化p65（P-p65）降低。qRT-PCR检测到Atg5和Atg7 mRNA表达上调，炎症因子Il-6和Mcp-1表达下降。此外，TFEB过表达降低衰老标志物（p16、p21、p53）表达，表明TFEB恢复可减轻细胞衰老。

**2.7 姜黄素类似物C1增强自噬并保护衰老肾脏免受LPS诱导的AKI**
C1处理衰老小鼠肾脏后，免疫荧光显示TFEB核转位增强，LC3-II水平升高，而TFEB总蛋白未显著恢复。C1部分但显著降低LPS诱导的血清肌酐和BUN升高，减轻肾小管损伤（PAS染色和管状损伤评分），降低肾损伤分子NGAL（中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白）表达，并抑制炎症因子Mcp-1和Tnfα的mRNA上调。

**讨论与结论**
讨论部分指出，衰老肾脏中自噬基础水平略高但应激诱导能力显著下降，这与TFEB下调密切相关。TFEB蛋白随年龄下降，但基础自噬活性升高，可能反映代偿机制；然而，一旦TFEB低于功能阈值，应激诱导的自噬响应严重受损。通过TAT-Beclin-1或C1激活自噬或TFEB，可减轻衰老肾脏损伤，提示自噬缺陷是衰老肾脏易感性的关键。此外，snRNA-seq数据还提示其他调控因子（如Rubcn）可能参与。研究结论：研究人员已利用体内小鼠和体外肾小管细胞培养模型验证了衰老肾脏的AKI易感性。研究人员证明，自噬反应缺失是衰老肾脏AKI易感性的关键。此外，研究人员已确定TFEB下调是衰老肾脏和衰老细胞中自噬缺陷的核心中介。药理学调节TFEB和自噬可能在脓毒症期间为老年个体提供肾脏保护。