《Microchemical Journal》：Cascade amplification powers a high-sensitivity electrochemical biosensor for accurate
Cordyceps sinensis identification
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•Au-TDNA探针可实现对冬虫夏草的基因级鉴定。•酸化有序介孔碳与金纳米棒协同作用可增强电化学信号强度。•无需标记物和酶的检测方法，操作快速、成本低且简单。引言冬虫夏草是由虫草菌寄生在鳞翅目蛾类幼虫身上形成的复合体，由真菌基质与干枯的幼虫宿主共同构成[1]。它属于国家二级保护珍
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Au-TDNA探针可实现对冬虫夏草的基因级鉴定。
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酸化有序介孔碳与金纳米棒协同作用可增强电化学信号强度。
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无需标记物和酶的检测方法，操作快速、成本低且简单。
引言
冬虫夏草是由虫草菌寄生在鳞翅目蛾类幼虫身上形成的复合体，由真菌基质与干枯的幼虫宿主共同构成[1]。它属于国家二级保护珍稀药材，具有多种生物活性，包括免疫调节、抗炎、抗肿瘤、抗氧化及抗衰老功效[2]。冬虫夏草不仅被用作传统中药，还作为日常保健的膳食补充剂，因此拥有庞大的消费群体。然而，野生冬虫夏草对生态环境要求极为严格，其自然分布范围十分有限[3]。目前人工培育技术还不够成熟，而市场需求持续上升，导致价格不断上涨，供需失衡问题十分严重[4]。此外，由于虫草种类繁多，普通消费者很难准确辨别真品冬虫夏草。在利益驱动下，一些不良商贩常常将其他真菌，比如感染了病原体的亚香棒虫草、凉山虫草、中国新疆的冬虫夏草以及军虫草，冒充为真正的冬虫夏草出售。更恶劣的是，还有用植物根茎、块根、面粉等材料制成的假冒产品，经过加工后模仿冬虫夏草的外观在市场上销售，欺骗消费者[5]、[6]。因此，开发一种特异性强、灵敏度高且可靠的检测方法来识别假冒冬虫夏草，对于保障市场秩序、食品安全以及药物疗效具有重要意义。
冬虫夏草含有复杂多样的化学成分，包括各种生物碱、皂苷和氨基酸，这些成分大多也存在于其他类似替代品中[7]、[8]、[9]。因此，依靠化学成分来区分冬虫夏草及其替代品的传统分析方法，如高效液相色谱法，效果十分有限[10]。内部转录间隔区序列是指核糖体DNA中18S和26S核糖体RNA基因之间的非编码区域[11]、[12]、[13]。不同物种间的ITS序列存在较大差异，这使得它们成为分类学、遗传学和系统发育研究中的重要分子标记[14]、[15]、[16]。在2015年版的《中国药典》补充规定中，引入了一种基于ITS序列的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析方法，以提高冬虫夏草鉴定的准确性和可靠性[17]、[18]。不过，该方法需要耗时的酶解过程，还需高质量的电泳凝胶，且无法实现精确定量，因此难以大规模应用[19]。实时荧光定量PCR技术则是在常规PCR检测中加入了同时包含荧光团和淬灭剂的双标记TaqMan探针[20]、[21]、[22]。在引物延伸过程中，与目标序列特异性结合的探针会被水解，释放出荧光团，从而实现定量检测[23]、[24]。基于TaqMan探针的实时PCR方法能够以高特异性和高灵敏度分析ITS序列，且反应时间相对较短[25]、[26]。例如，何等人就利用针对ApMat基因的TaqMan探针，通过实时定量PCR技术快速准确地检测出了导致杉树炭疽病的病原体[27]。然而，双标记探针的使用会大幅增加检测成本，还需使用昂贵的荧光PCR仪器，这也限制了该技术的广泛应用。
电化学分析方法具有操作简单、响应迅速、灵敏度高且成本低等优点[28]。近年来，这类方法已被广泛应用于化学分析、环境监测、生物医学、食品分析等多个领域[29]、[30]。电化学DNA传感器是一类将电化学技术与DNA杂交技术相结合的生物传感器，通常由捕获探针和信号探针构成[31]。通过特定的修饰方法，可将探针DNA固定在电极表面。当目标DNA与探针DNA发生杂交时，电极界面的电化学性质会发生改变，这一变化可通过电化学检测系统检测并转化为可量化的电信号[32]、[33]。例如，孟等人开发了一种结合催化发夹组装信号放大技术的新型钯纳米粒子-DNA电化学传感平台，可用于超灵敏地检测miR-21分子[34]。
金属纳米粒子以其优异的电子传输性能和良好的生物相容性而备受关注。在金、银、钯等贵金属中，钯纳米粒子具有理想的尺寸效应、较高的稳定性以及出色的催化活性，在电化学生物传感器的构建中展现出巨大潜力[35]、[36]、[37]。为进一步提升生物传感器的导电性和组装效率，人们通常会使用各种碳基材料对电极表面进行修饰。其中，有序介孔碳因其丰富的介孔结构、较大的比表面积以及优异的导电性而备受重视[38]、[39]、[40]。经过酸处理后，有序介孔碳表面会形成大量的羧基（–COOH），这使得带有氨基（–NH2）修饰的DNA链可以通过酰胺键稳定地固定在碳表面上[41]。
本研究提出了一种用于冬虫夏草样本基因级鉴定的新型电化学DNA传感平台。研究人员设计了一种特定的DNA序列（TDNA），能够选择性地识别并结合冬虫夏草的ITS区域。以TDNA修饰的金纳米棒作为信号探针，当其与底物对乙酰氨基酚发生反应时，会产生催化电流信号。与此同时，带有末端氨基的捕获探针通过酰胺键共价固定在经过羧基修饰的有序介孔碳表面上。在电化学检测阶段，该传感器无需任何标记物或酶，既不需要对探针进行荧光标记，也不依赖辣根过氧化物酶等生物酶来实现信号放大，其信号完全来源于金纳米棒介导的对乙酰氨基酚的固有电催化氧化反应。对于真正的冬虫夏草，目标DNA、捕获探针以及TDNA修饰的信号探针之间会发生互补杂交，形成稳定的传感界面，进而产生可测量的电化学信号。得益于有序介孔碳与金纳米棒的协同作用，该传感器具有更高的灵敏度，能够有效放大微弱的信号。而对于假冒的冬虫夏草样本，由于不存在序列互补性，信号探针无法与固定的捕获探针发生杂交，因此几乎不会产生电化学响应。
章节节选
酸功能化有序介孔碳的制备
有序介孔碳是通过SBA-15纳米结构模板法制备的。具体步骤为：先将0.3毫升98%浓硫酸用去离子水稀释至20毫升，再加入4.0克蔗糖，使其完全溶解。随后向溶液中加入4.0克SBA-15模板，将混合体系置于室温下真空环境中保持3小时，使模板充分浸渍在蔗糖溶液中。浸渍完成后，混合体系
材料表征：酸功能化有序介孔碳与金纳米棒
通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜对金纳米棒以及酸功能化有序介孔碳的形态和结构特征进行了分析。图1A和图1B分别展示了金纳米棒的透射电子显微镜图像。这些金纳米棒呈均匀的棒状结构，平均长度约为20纳米，宽度约为4纳米。图1C为金纳米棒的高分辨率透射电子显微镜图像，从中可以看出，晶格间距为0.142纳米对应的是(111)晶面
结论
综上所述，本研究利用冬虫夏草特有的ITS序列，将PCR扩增技术与电化学传感技术相结合，实现了中药材的基因级鉴定。在PCR扩增之后，Au-TDNA探针会选择性地与冬虫夏草的ITS序列结合，从而产生可测量的电化学信号。而对于假冒样品而言，由于不存在序列互补性，TDNA探针无法与ITS区域结合，因此不会产生相应信号
CRediT作者贡献说明
南辉：论文撰写——初稿撰写、软件应用、方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。林书静：论文撰写——初稿撰写、验证工作、资源获取、方法设计、实验研究、数据分析。赵琳：论文撰写——初稿撰写、软件应用、方法设计、实验研究、数据分析、数据整理。张洪义：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、资源获取、方法设计、数据分析、数据整理。张雨凡：论文撰写——审阅与编辑、研究指导、方法设计
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了河北省高层次人才团队建设专项项目（项目编号：253A5501D）、河北省分析科学技术重点实验室（项目编号：22567620H）以及河北大学交叉学科研究计划（项目编号：DXK202406）的支持。
Hui Nan|Shujing Lin|Lin Zhao|Hongyi Zhang|Yufan Zhang
