《Microchemical Journal》：Specific and visual identification of the culinary-medicinal mushroom
Pleurotus tuber-regium by ITS-based CRISPR/Cas12a assay
编辑推荐：
•基于ITS和CRISPR/Cas12a技术，建立了一种用于准确识别P. tuber-regium的可视化检测方法。•该检测方法在完成ITS序列扩增后，无需进行序列测定与比对即可快速识别蘑菇。•通过修改特定的crRNA，该方法已被成功用于识别C. molybdites。引言蘑菇因
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基于ITS和CRISPR/Cas12a技术，建立了一种用于准确识别P. tuber-regium的可视化检测方法。
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该检测方法在完成ITS序列扩增后，无需进行序列测定与比对即可快速识别蘑菇。
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通过修改特定的crRNA，该方法已被成功用于识别C. molybdites。
引言
蘑菇因其独特的风味和高营养价值而深受消费者喜爱。全球已记录的蘑菇物种约有14万种，许多国家都有采集和食用野生蘑菇的传统[1]。某些蘑菇具有多种食用和药用价值，可被用作新型食品、调味料以及健康补充品[2]、[3]、[4]。然而，蘑菇之间的相似性与多样性也导致了频繁的食品安全问题。在中国，近50%的口服中毒死亡病例是由蘑菇中毒引起的[5]。此外，市场上还存在因形态相似而造成的混淆，以及不同俗名带来的误导，这些都让消费者对食品安全忧心忡忡。因此，准确且便捷地识别蘑菇种类显得尤为重要。
Pleurotus tuber-regium是唯一能够产生菌核的平菇属物种，是一种富含生物活性多糖、必需氨基酸、必需脂肪酸、膳食纤维、矿物质、维生素及蛋白质的食用及药用真菌[6]。该物种的菌核和子实体具有抗肿瘤、降胆固醇、降压、抗肥胖、抗菌、抗氧化以及益生作用[7]。在实际应用中，P. tuber-regium的菌核曾被用于民间医学，治疗皮肤病、儿童营养不良、炎症性头痛、胃部疾病、感冒、哮喘、发热、糖尿病、高血压以及天花等疾病[8]。不过市场上有很多卖家将普通食用蘑菇冒充为药用型P. tuber-regium，这使得市场监管十分困难。传统的DNA条形码技术可通过扩增、测序、序列比对以及系统发育树分析来准确识别P. tuber-regium，虽然可靠但耗时较长[10]。为了进一步提高识别效率，Vasilita等人采用了基于Oxford Nanopore R10.4平台的实时DNA条形码技术，仅在6小时内就完成了285份样本的条形码分析[11]。总体而言，人们越来越倾向于使用更省时的分子检测技术。
成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白系统（CRISPR/Cas系统）已被广泛应用于基因编辑和快速分子诊断领域。近年来，基于CRISPR/Cas系统的核酸检测技术得到了大量研究，比如转基因作物的定量检测[12]、猴痘病毒的痕量检测[13]，以及真菌性角膜炎的临床诊断[14]。随着技术的发展，针对非核酸分析物的CRISPR/Cas12a基生物传感器也被开发出来，可用于检测Escherichia coli [15]。总体来看，CRISPR/Cas系统具备高度的特异性识别能力以及组合适应性：它可以通过等温扩增或热循环扩增对低丰度目标物质进行预扩增[16]、[17]，再结合电化学检测[18]或表面增强拉曼散射检测[19]进一步放大信号，最终通过荧光检测或侧流试纸条实现肉眼可见的检测结果[20]。除此之外，除了精确的核酸检测外，经过分子工程改造的CRISPR/Cas系统还可用于蛋白质和小分子等非核酸目标的定性与定量分析[15]，展现出广阔的应用前景。CRISPR/Cas12a属于CRISPR家族成员。Cas12a通过原间隔序列相邻基序识别目标DNA，并在PAM序列的远端切割目标双链DNA[21]。一旦与目标链结合，CRISPR/Cas12a就会激活其转切活性，非特异性地切割系统中的所有单链DNA[22]、[23]。这一特性使得CRISPR/Cas12a成为开发高灵敏度分子诊断工具的关键组件。目前，ITS是用于真菌物种鉴定最常用的分子标记之一[24]。此外，由于ITS区域具有多拷贝特性、近缘物种间序列差异显著，且两侧均存在普遍保守的引物结合位点，它现已成为蘑菇分子鉴定中最常用的靶序列[25]。基于这些特点，可以开发出基于ITS的CRISPR/Cas12a检测方法，用于准确识别P. tuber-regium（见图1）。此外，中国常见的有毒蘑菇C. molybdites也被用来验证该检测方法的特异性和灵敏度。本研究旨在建立一种更为快捷且准确的可视化检测方法，用于识别P. tuber-regium菌株，同时为仅通过crRNA替换来实现蘑菇鉴定提供参考。
章节要点
化学品与试剂
LbaCas12a核酸酶（Cas12a）、10×Cas12a-dsDNA缓冲液I以及10×Cas12a-ssDNA缓冲液II购自中国苏州的Novoprotein Scientific Inc.；10×Taq缓冲液（含Mg2+）、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）以及dNTP混合液（各2.5 mM）购自中国南京的Vazyme Biotech Co. Ltd.。本研究使用的所有引物均由中国武汉的Wuhan Tsingke Biotechnology Co., Ltd.合成；crRNA则由中国湖州的Huzhou Hippo Biotechnology Co., Ltd.合成，而ssDNA的合成则由
基于ITS的CRISPR/Cas12a系统的检测机制
该检测系统是通过crRNA引导的Cas12a识别P. tuber-regium的ITS序列来启动工作的（见图2B）。P. tuber-regium的ITS序列与其他类群存在差异，且来自不同来源的菌株之间也存在序列变异[24]。不过，对不同来源的P. tuber-regium菌株进行多序列比对后发现，ITS序列中存在一个变异保守的类似区域（见图2A、C）。正是基于这一区域，研究人员设计出了特定的crRNA
结论
本研究通过将通用的ITS-PCR扩增技术与CRISPR/Cas12a检测技术相结合，开发出一种能够准确识别P. tuber-regium和C. molybdites的可视化检测方法。该检测方法可在ITS扩增后立即进行目标基因检测，无需进行序列测定与比对，因此相比ITS测序而言，能更高效且低成本地识别P. tuber-regium。此外，基于ITS的CRISPR/Cas12a检测方法还可以进一步拓展应用范围
CRediT作者贡献说明
Caiyun Long：撰写——初稿、可视化分析、方法设计、数据整理。Linhuizi Xiang：撰写——审阅与编辑、概念构思。Dongmei Liu：撰写——审阅与编辑、研究指导、概念构思。Ting Hu：撰写——审阅与编辑。Gong Chen：撰写——审阅与编辑。Binrong Ke：提供实验资源。Xueyan Sun：撰写——初稿、方法设计、资金申请、概念构思。Xihong Zhao：撰写——审阅与编辑、研究指导、概念构思。
利益冲突声明
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关联关系。
致谢
本研究得到了以下机构的资助：中国国家自然科学基金（项目编号32402651）、湖北省自然科学基金（项目编号2024AFB274）、湖北省教育厅科研计划青年人才项目（项目编号Q20231511），以及武汉工业学院科学研究基金（项目编号K2023058）。
Caiyun Long|Linhuizi Xiang|Dongmei Liu|Ting Hu|Gong Chen|Zhilong Wang|Binrong Ke|Xueyan Sun|Xihong Zhao
