《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Deletion of Circadian Rhythms Gene BMAL1 Impairs the Intestinal Epithelial Barrier and Exacerbates Intestinal Inflammation by Inducing Pyroptosis
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昼夜节律钟在各种炎症性和自身免疫性疾病（包括溃疡性结肠炎(UC)）的发病机制中起着关键作用。核心转录因子BMAL1的缺失加剧了结肠炎的严重程度。然而，BMAL1在UC中的潜在分子机制仍不清楚。研究人员发现，BMAL1在UC组织和脂多糖(LPS)诱导的MODE-
昼夜节律钟在各种炎症性和自身免疫性疾病（包括溃疡性结肠炎(UC)）的发病机制中起着关键作用。核心转录因子BMAL1的缺失加剧了结肠炎的严重程度。然而，BMAL1在UC中的潜在分子机制仍不清楚。研究人员发现，BMAL1在UC组织和脂多糖(LPS)诱导的MODE-K细胞中表达下调，而CXCL1高表达。BMAL1的过表达减少了LPS诱导的MODE-K细胞焦亡(pyroptosis)，并恢复了ZO-1、Claudin-1和Occludin的表达，从而改善了肠上皮屏障功能。机制上，BMAL1通过抑制其启动子活性来负调控CXCL1表达。此外，蛋白质组学分析确定MEF2A为BMAL1的下游蛋白。BMAL1对MODE-K细胞的保护作用是通过直接负调控CXCL1或间接负调控MEF2A表达实现的。因此，BMAL1在维持肠上皮屏障完整性中发挥保护作用，并代表UC治疗的潜在靶点。
**论文解读：昼夜节律基因BMAL1缺失通过诱导细胞焦亡损害肠上皮屏障并加剧肠道炎症**
**研究背景与问题**
溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性、特发性炎症性肠病，主要累及结肠，发病机制涉及肠上皮屏障破坏、细胞凋亡和继发性炎症反应之间的恶性循环。肠上皮细胞（IECs）通过紧密连接（TJs）维持屏障功能，TJs蛋白（如ZO-1、Claudin-1、Occludin）的缺失可增加肠道通透性，促进结肠炎发展。昼夜节律钟是高度保守的内源性分子系统，调控24小时周期内的生理过程，对肠道运动、分泌、血流及屏障完整性至关重要。研究发现，昼夜节律紊乱或核心基因缺失可加剧小鼠肠道炎症和上皮失调，但具体分子机制尚不明确。BMAL1（芳烃受体核转位因子样蛋白1）是哺乳动物生物钟的关键转录激活因子，在UC患者外周血中与C反应蛋白（CRP）和粪便钙卫蛋白（Fcal）水平呈负相关，其缺失可加重葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎。然而，BMAL1调控肠上皮屏障完整性的分子机制仍未阐明。本研究旨在探究BMAL1在MODE-K细胞中的作用及机制，为UC治疗提供新靶点。
**研究内容与结论**
研究人员通过临床样本、小鼠模型和细胞实验，系统分析了BMAL1在UC中的表达变化、功能及下游机制。结论如下：BMAL1在UC患者结肠组织、DSS诱导小鼠结肠及LPS刺激的MODE-K细胞中均显著下调，而CXCL1高表达。BMAL1过表达可减少LPS诱导的细胞焦亡（pyroptosis），恢复TJs蛋白表达，改善肠上皮屏障功能。机制上，BMAL1通过直接结合并抑制CXCL1启动子活性来负调控CXCL1；同时，蛋白质组学鉴定MEF2A为BMAL1的下游蛋白，BMAL1通过负调控MEF2A表达间接抑制炎症通路（如P65磷酸化）和焦亡相关因子（NLRP3、GSDMD、cleaved caspase-1）。体内实验进一步证实，BMAL1过表达可减轻DSS诱导的结肠缩短、疾病活动指数（DAI）升高、炎症因子分泌及焦亡，并恢复TJs蛋白表达。因此，BMAL1通过直接负调控CXCL1或间接负调控MEF2A两条平行通路发挥保护作用，是UC的潜在治疗靶点。该论文发表在《MEDIATORS OF INFLAMMATION》。
**主要关键技术与方法**
本研究采用以下关键技术：1）临床样本队列：来自金坛医院，包括15例确诊UC患者和15例无结肠炎或肿瘤的内镜对照，采集结肠黏膜组织。2）小鼠模型：C57BL/6小鼠（雄性，6–8周龄），通过饮用3% DSS水溶液诱导结肠炎，并使用慢病毒（通过Villin启动子驱动BMAL1在IECs中过表达）进行结肠内注射。3）细胞模型：小鼠肠上皮细胞系MODE-K，经LPS（1 μg/mL）刺激4小时模拟UC。4）分子生物学技术：RT-qPCR、Western blot、免疫组化（IHC）、免疫荧光（IF）、双荧光素酶报告基因、染色质免疫沉淀（ChIP）、流式细胞术（检测凋亡和焦亡）、iTRAQ标记与LC-MS/MS蛋白质组学、ELISA（检测IL-1β、TNF-α、IL-6）、CCK-8细胞活力检测。
**研究结果**
**3.1 昼夜节律基因表达在UC患者中受干扰**：通过RT-qPCR和Western blot检测15例UC患者结肠组织，发现核心时钟基因CLOCK、BMAL1、CRY1、CRY2、PER1、PER2的mRNA和蛋白水平均显著下调，而CXCL1显著上调。结合文献，选择BMAL1和CXCL1进行后续研究。
**3.2 BMAL1和CXCL1在UC动物模型中的表达分析**：DSS诱导小鼠结肠炎后，H&E染色显示上皮隐窝结构破坏、免疫细胞浸润增加；Western blot显示TJs蛋白（ZO-1、Claudin-1、Occludin）表达下降。IHC和Western blot证实BMAL1表达降低、CXCL1表达升高，与临床样本一致。
**3.3 BMAL1和CXCL1在LPS诱导的肠上皮细胞中的表达分析**：LPS刺激MODE-K细胞后，TJs蛋白下调，BMAL1 mRNA和蛋白水平降低，CXCL1升高，与体内结果一致。
**3.4 BMAL1改善LPS诱导的肠上皮细胞损伤和焦亡**：BMAL1过表达可上调自身表达并负调控CXCL1，降低炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）分泌，减少细胞凋亡和焦亡率，抑制焦亡相关蛋白（NLRP3、GSDMD、cleaved caspase-1）表达，同时恢复TJs蛋白表达。
**3.5 BMAL1通过调控CXCL1表达减轻LPS诱导的肠屏障破坏**：使用shRNA敲低BMAL1后，CXCL1表达升高，细胞凋亡和焦亡增加，TJs蛋白下降。共敲低CXCL1可部分逆转这些变化。双荧光素酶和ChIP实验证实BMAL1直接结合CXCL1启动子并抑制其活性。
**3.6 BMAL1通过调控MEF2A表达改善LPS诱导的肠上皮细胞屏障损伤和焦亡**：蛋白质组学分析鉴定出485个上调、557个下调的差异表达蛋白，其中MEF2A变化显著。敲低BMAL1上调MEF2A和CXCL1，抑制细胞活力；共敲低MEF2A可逆转炎症因子分泌、P65磷酸化、焦亡相关蛋白（NLRP3、IL-1β、ASC）升高，并恢复TJs蛋白表达。
**3.7 BMAL1在体内改善DSS介导的UC症状**：BMAL1过表达可减轻DSS诱导的结肠缩短、降低DAI评分，减少促炎细胞因子，抑制焦亡标志物，并恢复TJs蛋白表达。
**讨论与结论**
讨论部分总结：本研究首次揭示BMAL1通过直接负调控CXCL1或间接负调控MEF2A两条平行通路保护肠上皮屏障。BMAL1缺失导致CXCL1和MEF2A上调，促进焦亡和屏障破坏。研究还指出，免疫细胞反应具有昼夜节律性，BMAL1可能通过脑-肠轴发挥调节作用。局限性包括：样本量较小（15例/组），需扩大验证；BMAL1对MEF2A的调控机制可能涉及间接途径，需进一步研究。研究结论部分翻译如下：最后，总结来说，本研究探讨了BMAL1在肠上皮炎症中的作用和机制。研究结果表明，BMAL1通过直接负调控CXCL1或间接负调控MEF2A表达，以及减少肠上皮炎症过程中的细胞焦亡，从而增强肠上皮屏障功能。因此，BMAL1可能作为一个潜在靶基因，为UC治疗提供理论基础。
