PHOX2B 聚丙氨酸重复突变改变先天性中枢性低通气综合征神经元祖细胞的转录组

《Neurobiology of Disease》：PHOX2B polyalanine repeat mutation alters the transcriptome of neuronal progenitor cells in congenital central hypoventilation syndrome

　　

配对样同源框2B（paired-like homeobox 2B，PHOX2B）基因突变被用作先天性中枢性低通气综合征（Congenital Central Hypoventilation Syndrome，CCHS）的诊断标志物。突变基因/蛋白影响神经嵴细胞胚胎发育，从而导致先天性中枢性低通气综合征（CCHS）。当个体同时患有赫希施普龙病（Hirschsprung's disease，HSCR）与CCHS时，被称为哈达德综合征（Haddad syndrome，HS）。先前关于CCHS/HS的研究主要集中在突变蛋白的构象动力学上，且仍存在争议。此处研究人员对患者来源的、与CCHS/HS神经发育表型相关的神经上皮干细胞（neuroepithelial stem cells，NESCs）进行了RNA测序（RNA-sequencing），发现PHOX2B-PARM对细胞的转录谱有深远影响。杂合子细胞中单拷贝的PHOX2B-PARM导致了大于8倍的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。这包括据报道参与神经发育的基因，如STMN2、L1CAM、ONECUT2和NFASC。在患者细胞中，主要与L1CAM相互作用和突触发生信号通路（synaptogenesis signaling pathway）驱动的神经元发育和突触组织相关基因显著富集。研究结果不仅强调了CCHS/HS适用模型的使用，还为未来的实验验证提供了明确的路径。

该研究围绕先天性中枢性低通气综合征（CCHS）及其合并赫希施普龙病（HSCR）的哈达德综合征（HS）展开。CCHS是一种严重的神经发育遗传性疾病，导致自主神经系统功能障碍，HSCR则因肠神经系统神经节细胞缺失致肠梗阻，二者目前均无有效治愈手段，仅依赖正压通气、膈肌起搏及手术切除无神经节肠段等对症支持治疗。既往脑结构与功能研究观察不一，包括正常脑结构、非特异改变及灰质体积减少等，相关脑区如脑干、孤束核、蓝斑、弓状核等虽被关注，但因小鼠呼吸控制脑区RTN/pFRG在人类中定位不明，小鼠模型数据相关性存疑。PHOX2B作为自主神经系统发育的转录因子，其聚丙氨酸重复突变（PARM，野生型20个丙氨酸，致病性增加4至13个）是CCHS诊断标志物，突变蛋白的分子动力学如聚集形成与胞质错位研究长期存在争议，且PARM功能及突变导致CCHS/HS的下游靶标这一核心问题尚未明确。既往细胞模型或因PHOX2B内源性表达异常（如神经母细胞瘤过高、HeLa细胞缺失），难以模拟患者杂合子遗传背景与时空表达，故需建立能模拟人类早期神经发育的患者来源模型以探究转录组影响及下游机制。

研究人员纳入美国圣地亚哥雷迪儿童医院的2例HS先证者（均为男性，携带PHOX2B 20/27丙氨酸重复扩展即+7丙氨酸突变）及其家属作为对照（先证者1之父、先证者2之母为野生型20/20），通过外周血单核细胞（PBMCs）重编程为诱导多能干细胞（iPSCs）并分化为神经上皮干细胞（NESCs）；利用PHOX2B启动子驱动eGFP标签结合荧光激活细胞分选（FACS）分离PHOX2B阳性（占约1%）与阴性细胞；对分选细胞进行高通量RNA测序（RNA-seq）并用STAR比对、salmon定量及DESeq2分析差异表达基因（DEGs），采用基因本体（GO）、基因集富集分析（GSEA）、Ingenuity通路分析（IPA）及GTEx数据布尔推论分析下游靶标，以RT-qPCR验证候选基因表达。

研究结果如下：

3.1. 重编程、分化及HS PHOX2B⁺细胞分离。研究人员将先证者与对照PBMCs成功重编程为iPSCs并分化为NESCs，PHOX2B抗体染色确认小于1%细胞表达PHOX2B；通过PHOX2B启动子-eGFP慢病毒感染实现PHOX2B表达细胞eGFP标记与共定位验证，分选获得四组细胞：先证者PHOX2B阳性（P2BM）、对照PHOX2B阳性（P2BW）、先证者PHOX2B阴性（NP2BM）、对照PHOX2B阴性（NP2BW）用于测序。

3.2. 与PHOX2B相关的新靶标。研究人员对比对照组内PHOX2B阳性与阴性细胞RNA-seq数据，确认PHOX2B及已知靶标PHOX2A、ISL1、GAP43、NEFL过表达，鉴定出228个DEGs（校正P<0.05）；布尔推论分析显示PHOX2B与PHOX2A及46个高倍变化基因中超50%呈正相关，长链非编码RNA LINC00682与PHOX2B相关性优于已知靶标；仅RET在PHOX2B阳性与阴性间显著差异，TH、TLX2等低表达或未检出，GTEx中PHOX2B与RET、TLX2关联更强，确立正常PHOX2B下游新靶标。

3.3. PHOX2B-PARM诱导显著转录改变。主成分分析（PCA）显示PC2（24%方差）将患者PHOX2B阳性细胞与其余样本（含患者PHOX2B阴性）分开；对照与患者PHOX2B阳性比较得271个DEGs（175上调、96下调），为背景比较（PHOX2B阴性对照vs先证者）36个的8倍以上，68个DEGs log₂倍数变化>2、18个>3；RT-qPCR验证10个候选基因（如STMN2、L1CAM、ONECUT2、NFASC等）表达趋势与RNA-seq一致，证实杂合PARM对PHOX2B表达NESCs转录组的显著影响。

3.4. PHOX2B-PARM影响神经元发育相关基因。折叠变化特异性富集分析（FSEA）显示患者与对照PHOX2B阳性DEGs的顶部生物学过程（GO-BP）均关神经元发育（神经元生成、分化、发育）与突触组织（突触信号、顺行跨突触信号、化学突触传递），细胞组分（GO-CC）为轴突、神经元突起、突触、突触前膜；神经元生成相关64基因中49个（>75%）、突触组织29基因中25个在患者上调；正常PHOX2B表达的DEGs富集于神经元生成但候选基因不同，还涉及管发育、谷氨酸能突触等。

3.5. PHOX2B-PARM对L1CAM相互作用与突触发生信号通路有重大影晌。IPA显示顶部受影响通路为L1CAM相互作用（激活z评分2.714）、突触发生信号通路（2.138）、NCAM神经突生长、SNARE信号等（脂肪生成通路z=-0.71抑制外均激活），组成基因L1CAM、NCAM1、NFASC、SCN1A、SCN3B、TUBB4A等多上调；PHOX2B-PARM DEGs激活神经细胞发育（z=3.37）等功能，抑制胃肠肿瘤（z=-1.03）；正常PHOX2B顶部通路中胚胎干细胞转录调控网络抑制（z=-1.508）、L1CAM相互作用激活（z=2.333）；PHOX2B-PARM整体激活发育过程、神经递质与神经系统信号，正常PHOX2B关联细胞生长增殖抑制与转录调控。

讨论部分总结：本研究首次报道患者来源PHOX2B表达神经元祖细胞（携PHOX2B-PARM）早期神经发育阶段转录组，克服既往小鼠模型转化受限、PHOX2B阳性细胞罕见瞬时、细胞模型表达异常及杂合毒性增益功能等局限。功能上PHOX2B-PARM与野生型二聚化且保留DNA结合，内源水平未检聚集体而近期研究提示相变凝聚体影响转录；结果与唯一患者来源研究共享“神经元发育”过程及5/6共同DEGs（NETO1、SFRP2、STRA6下调，LOC101927999、CHGB上调），TENM4等在神经母细胞瘤模型亦上调；STMN2、ONECUT2等顶级DEGs在iPSC运动神经元单细胞RNA-seq中关联神经系统发育，PHOX2B敲除交感前体细胞STMN2缺失，PARM致其过表达或抑制神经突生长；小鼠Phox2b^LacZ/LacZ后脑顶级基因Sncg、Igfbp5在突变细胞过表达（分别涉神经元死亡与凋亡）；L1CAM、NFASC、NCAN等上调激活现有过程，提示PARM扰乱细胞谱系致NESCs过早神经元生成与分化。正常PHOX2B验证PHOX2A等为靶标及CRC基因PHOX2A、KLF7、NFIB、ISL1高表达，DBH无直接关联而RET、TLX2更好相关，揭示转录相关性组织特异性。综上，识别PHOX2B-PARM下游靶标为理解HS分子机制提供路径，避开蛋白构象争议，为实验验证指明方向。

研究结论部分翻译：此处研究人员展示了携PHOX2B-PARM单拷贝、表达PHOX2B的神经元祖细胞RNA-seq数据，重现HS患者早期神经发育阶段转录组谱；据研究所知，这是首项针对患者来源PHOX2B表达神经元祖细胞的研究，研究人员识别了PHOX2B-PARM下游靶标，并预期部分靶标可能具治疗HS或CCHS的潜力。早期小鼠与人类细胞系研究因适用模型系统局限致转化潜力受阻，包括PHOX2B表达细胞群罕见瞬时、早期神经发育时空动态、小鼠模型人类疾病根本局限及PHOX2B-PARM杂合毒性增益功能机制；通过患者来源NESCs结合FACS，研究人员解决上述局限并获得密切模拟HS早期发病关键阶段的细胞结果。功能上PHOX2B-PARM已示与PHOX2B二聚化，因突变位于同源域外，预期蛋白保留DNA结合特性，诸多研究示PHOX2B-PARM聚集但研究人员与他人未检测到，推测内源水平表达不聚集，近期研究揭示其触发快速相变入固态凝聚体捕获野生型PHOX2B，致病PARM凝聚体或显著影响转录谱。本研究显示患者来源PHOX2B表达NESCs独特转录组聚类分离，迄今仅三篇HS/CCHS转录组分析，与唯一患者来源研究均突出“神经元发育”过程且5/6共同DEGs调控一致，尽管细胞类型、对照、PARM长度及PHOX2B表达水平不同；与Phox2b^LacZ/LacZ小鼠胚胎后脑顶级DEGs Sncg、Igfbp5在突变细胞过表达（校正P<0.001），EBF2、NEUROD4亦过表达涉神经元分化；神经元祖细胞转录组决定神经元形态连接功能，PARM致8倍DEGs或促发育中神经元大面积重塑，受影响过程均关神经元生成与突触组织，多基因上调（L1CAM、NFASC、NCAN等）激活现有过程，提示PARM扰乱正常细胞谱系致NESCs过早神经元生成与分化。并行正常PHOX2B关联基因中PHOX2A等过表达验证其为靶标及CRC基因高表达，DBH无直接关联而RET、TLX2更好相关显转录相关性组织特异性。总结，HS致病基因明确下，识别失调下游靶标为理解分子机制最短路径；克服局限获PHOX2B-PARM靶标分子，避构象争议并提供验证路径，因分析细胞为HS核心，本研究是理解PHOX2B-PARM在HS功能后果的重要步骤。

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