绘制人类小肠和类器官中的间充质多样性

《Nature Cell Biology》：Mapping mesenchymal diversity in the human small intestine and organoids

　　

摘要：人类小肠发育过程中多种间充质群体的组织对组织结构和功能至关重要，但尚未被明确定义。在本研究中，研究人员利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据构建了一个涵盖人类小肠细胞多样性的Xenium空间转录组学基因面板，以构建发育中人类小肠的全组织尺度单细胞分辨率综合图谱。研究人员定义了五个亚群，它们位于固有层和黏膜下层内的离散解剖位置——上皮下细胞、固有层成纤维细胞、黏膜下层成纤维细胞、平滑肌细胞和CXCL13⁺成纤维细胞。研究数据建立了分子标记，以在测序和成像数据中区分这些群体。研究人员利用这一高分辨率图谱来探究细胞间信号传导，将多能干细胞衍生的人类小肠类器官进行基准测试，并展示该资源如何将相对空间组织纳入组织分析，这对模拟发育、再生和疾病具有广泛意义。

**论文解读：绘制人类小肠与类器官的间充质多样性图谱**

**研究背景与问题提出**

小肠的精确组织（从负责营养吸收的隐窝-绒毛轴到与肠神经系统（ENS）协调蠕动的肌肉层）对其功能至关重要。尽管单细胞方法已广泛用于研究成人和发育中人类肠道的细胞异质性，涵盖了上皮、肌肉组织和ENS等组织尺度特征，但中胚层来源的成纤维细胞群体（也称为间充质和/或基质）的分子特性和空间组织仍未被充分定义。在模式生物小鼠中，近年研究已根据分子身份、功能或定位重新定义了“成纤维细胞”、“肌成纤维细胞”等历史术语，并识别出多个亚群，如高表达Pdgfra和Foxl1的上皮下“telocytes”，以及低表达Pdgfra的“trophocytes”和“Pdgfra-low stroma”。然而，这些工作主要基于小鼠，对人类发育和类器官中成纤维细胞群体的理解严重滞后。因此，构建一个全面、空间解析的人类小肠发育图谱，明确成纤维细胞亚型相对于其他所有细胞类型的身份和位置，是当前研究的迫切需求。

**研究内容、结论与意义**

本研究系统性定义了发育中人类肠道的分子和时空异质性，重点聚焦于尚未明确的成纤维细胞群体。研究人员整合了已公开的涵盖受孕后5-21周的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，识别高度富集的标记基因，并据此设计了包含292个基因的10X Xenium探针组。随后，对7个不同发育阶段（受孕后7-22周）的完整小肠样本（十二指肠、空肠、回肠和结肠）以及成人十二指肠全层样本和两种移植诱导多能干细胞衍生的人类小肠类器官模型（tHIOs）进行了Xenium空间转录组学成像。通过分析，研究人员识别出平滑肌细胞（SMCs）以及四个占据离散解剖位置的亚群：上皮下细胞（SECs）、固有层成纤维细胞（LPFs）、黏膜下层成纤维细胞（SMFs）和CXCL13⁺成纤维细胞。将该图谱应用于两种不同方法衍生的tHIOs，发现方法间存在细微差异，表明细胞异质性和空间组织都是评估tHIOs与体内人类小肠保真度的重要指标。这项研究提供了一个空间分辨的、组织尺度的发育中人类小肠蓝图，建立了可识别和追踪成纤维细胞群体的分子特征，并通过对tHIOs进行基准测试，证明了细胞类型组成和精确细胞拓扑结构是评估体外组织的关键指标，对类器官设计、疾病建模和治疗筛选具有广泛意义。该论文发表在《Nature Cell Biology》。

**主要关键技术方法**

1. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）**：整合公开的人类胎儿小肠scRNA-seq数据集（涵盖5-21周），用于识别细胞类型和标记基因。
2. **Xenium空间转录组学**：设计定制292基因探针组，对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行亚细胞分辨率成像，实现单细胞水平的空间基因表达分析。
3. **CytoSPACE空间插补**：将scRNA-seq数据的高维转录组信息概率性地映射到Xenium空间图谱上，以克服Xenium探针组基因数量有限的问题，实现全转录组深度的空间分析。
4. **CellChat v2细胞通讯分析**：结合插补后的空间数据进行配体-受体相互作用推断，预测空间背景下的细胞间信号网络。
5. **Slingshot伪时间分析**：对固有层成纤维细胞（LPFs）进行轨迹推断，揭示其发育过程中的基因表达动态变化。
6. **荧光原位杂交（FISH）验证**：使用RNAscope多重FISH技术，在独立生物样本中验证关键标记基因的空间表达和细胞定位。

**研究结果**

**Spatial transcriptomics identifies major cell classes in the developing human intestine（空间转录组学识别发育中人类肠道的主要细胞类别）**
研究人员利用scRNA-seq数据设计Xenium探针组，对7个发育时间点（54-142天）的小肠组织进行空间转录组学分析。通过使用CDH1、VIM、PECAM1等经典标记，识别出上皮、成纤维细胞、内皮、免疫、ENS和平滑肌细胞等主要细胞类别。空间数据揭示了组织结构和组成，与scRNA-seq相比，Xenium捕获了更接近原生比例的细胞组成，并观察到肌层黏膜在80-105天期间分化。

**Identification of diverse fibroblast populations within the developing intestine（识别发育中肠道内的多种成纤维细胞群体）**
从scRNA-seq数据中提取成纤维细胞，去除平滑肌细胞、周细胞、增殖细胞和Cajal间质细胞后，通过聚类分析识别出三个主要亚群：SECs、LPFs和SMFs，以及一个晚期出现的CXCL13⁺成纤维细胞。Xenium数据也确认了这四个亚群的存在，并定义了每个亚群的高表达标记基因（如SECs的F3，LPFs的FABP5/ADAMDEC1，SMFs的SHISA3，CXCL13⁺的CXCL13）。

**Localization of SECs, LPFs, SMFs and CXCL13⁺ cells within the intestine（SECs、LPFs、SMFs和CXCL13⁺细胞在肠道内的定位）**
通过Xenium成像和FISH验证，明确了各成纤维细胞亚群的精确空间位置：SECs（F3⁺）紧邻上皮，沿隐窝-绒毛轴形成单层细胞；LPFs（FABP5⁺/ADAMDEC1⁺）位于SEC层下方的绒毛核心，且标记表达具有动态变化（早期FABP5高表达，晚期ADAMDEC1高表达）；SMFs（SHISA3⁺）位于黏膜下层，介于肌层黏膜和肌层外膜之间；CXCL13⁺成纤维细胞罕见，出现在隐窝颈部的SEC层内或Peyer's patches区域。

**Enhancing robustness of spatial transcriptomic data through spatial imputation（通过空间插补增强空间转录组数据的稳健性）**
为克服Xenium探针组基因数量限制，研究人员使用CytoSPACE将122-132天scRNA-seq数据插补到142天Xenium图谱上。插补后，应用CellChat成功预测了EGF、WNT和HH等已知信号通路的空间方向性，如EGF信号从肠干细胞和肠上皮细胞发出，WNT信号从肌层黏膜平滑肌细胞发出，证实了该方法的有效性。

**Creating a spatial atlas of pluripotent stem cell-derived HIOs（创建多能干细胞衍生HIOs的空间图谱）**
对EGF和EREG两种方法分化并移植后的tHIOs进行Xenium分析，发现两者均形成了类似发育中小肠的多层结构，包含上皮、成纤维细胞、平滑肌、ENS和内皮，但缺乏免疫细胞。两种tHIOs的细胞组成和空间组织总体相似，但EREG-tHIOs表现出更成熟的特征，如LPFs更倾向于ADAMDEC1⁺成熟状态，而上皮F3表达缺失。

**Identification of diverse fibroblast populations within tHIOs（识别tHIOs中的多种成纤维细胞群体）**
tHIOs中成功识别出SECs、LPFs和SMFs，但缺乏CXCL13⁺成纤维细胞。成纤维细胞的空间组织与体内高度相似：SECs紧贴上皮，LPFs位于绒毛核心，SMFs位于肌层黏膜和肌层外膜之间。通过计算最近邻距离并进行层次聚类，发现EREG-tHIOs的细胞空间组织更接近晚期胎儿样本（>105天），而EGF-tHIOs则不一致，表明其发育成熟度不均一。

**A spatial atlas of the adult duodenum（成人十二指肠的空间图谱）**
对成人十二指肠全层样本的Xenium分析显示，所有主要细胞类别和成纤维细胞亚型（SECs、LPFs、SMFs、CXCL13⁺）均存在，且空间定位与胎儿组织一致。但细胞比例有显著变化：LPFs比例从胎儿的~25%增至成人的64.67%，SMFs则从44.8%降至16.20%，同时SMFs的空间分布变得松散。

**讨论与结论**

**讨论总结**：本研究通过整合单细胞和空间转录组学，精确解析了人类小肠发育中四个转录组和空间上离散的成纤维细胞谱系（SECs、LPFs、SMFs、CXCL13⁺），并建立了其分子特征和空间定位。该图谱作为基准，揭示了tHIOs在细胞类型丰度和空间组织上的保真度，发现EREG-tHIOs比EGF-tHIOs更成熟，但两者均缺乏CXCL13⁺细胞，提示相对不成熟和/或缺乏免疫细胞。研究局限性包括Xenium探针组基因深度有限，但通过CytoSPACE插补得以缓解。该图谱为器官工程和疾病建模提供了定量框架，并展示了将转录组图谱整合到空间分辨的器官发生蓝图中去的通用策略。

**研究结论翻译**：通过整合单细胞和空间转录组学，研究人员完善了支撑人类小肠发育的肠道细胞类型组织，并为类器官工程和疾病建模提供了一个定量框架。除了细胞类型编目，这项工作还展示了一种将转录组图谱整合到空间分辨的器官发生蓝图中去的通用策略。随着空间多组学技术的成熟，此类蓝图对于解析细胞间通讯、识别先天性及炎症性疾病中的关键细胞类型和位置，以及工程化能够忠实再现人类生物学的可移植组织将不可或缺。