MLL4通过STAT3介导的线粒体功能保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤

《Redox Biology》：MLL4 Protects Cardiomyocytes against Ischemia-Reperfusion Injury through STAT3-Mediated Mitochondrial Function

　　

心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI）是心肌缺血后血运重建过程中不可避免的病理生理反应。尽管具有临床重要性，但针对MIRI的有效靶向治疗仍是一个未满足的医疗需求。混合系白血病4（mixed-lineage leukemia 4, MLL4），作为SET家族组蛋白甲基转移酶的成员，对组蛋白H3赖氨酸4（histone H3 lysine 4, H3K4）具有特定的甲基转移酶活性。本研究确立了MLL4在MIRI发病机制中的保护作用。研究人员利用心肌细胞特异性Mll4敲除小鼠以及通过左前降支冠状动脉结扎诱导的体内缺血再灌注（ischemia-reperfusion, I/R）模型，观察到I/R后心脏组织中MLL4表达显著上调。心肌细胞中Mll4的基因敲除明显加剧了MIRI的急性和慢性阶段。在体外，新生大鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs）中Mll4敲低在缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）条件下放大了线粒体功能障碍和凋亡。整合分析靶向裂解与标记测序（Cleavage Under Targets and Tagmentation sequencing, CUT&Tag-seq）和RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）揭示，Mll4缺失导致Stat3基因组位点处H3K4单甲基化（H3K4me1）和组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）富集显著减少。机制上，MLL4通过沉积H3K4me1和H3K27ac作为Stat3的转录激活因子，从而促进STAT3转录。这一调控级联最终控制STAT3依赖的线粒体稳态。总之，这些发现将MLL4鉴定为MIRI的关键表观遗传调控因子，并提示其治疗靶向可能为减轻再灌注损伤提供有前景的策略。

**MLL4通过STAT3介导的线粒体功能保护心肌细胞免受缺血再灌注损伤：研究解读**

**研究背景与问题**

冠状动脉疾病是全球发病率和死亡率的主要原因之一。及时的血运重建可减少心肌梗死面积，但再灌注过程本身也会对心肌造成不可逆损伤，即心肌缺血再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury, MIRI）。MIRI是心肌梗死后血运重建过程中不可避免的病理生理现象，严重影响患者预后。然而，其复杂的病理生理机制尚未完全阐明，且缺乏有效的临床干预手段。表观遗传学（通过DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA调控影响基因表达，而不改变DNA序列本身）在心血管疾病中的作用日益受到关注。MIRI涉及氧化应激、活性氧（reactive oxygen species, ROS）过度生成、钙超载、炎症和线粒体功能障碍等多种机制，其中线粒体功能障碍是核心事件。组蛋白修饰，特别是组蛋白H3赖氨酸4（H3K4）甲基化，在基因表达调控中发挥关键作用。混合系白血病4（mixed-lineage leukemia 4, MLL4）是SET家族组蛋白甲基转移酶成员，对H3K4位点具有特异性甲基转移酶活性。既往研究表明，MLL4在心脏发育中至关重要，但其在成年心肌组织中的生物学功能及在心血管疾病发生发展中的精确机制仍不清楚。因此，开展本研究旨在阐明MLL4在MIRI中的作用及其分子机制，为MIRI治疗提供新靶点。

**研究内容与结论**

研究人员利用心肌细胞特异性Mll4敲除（Mll4-cKO）小鼠和体内缺血再灌注（I/R）模型，发现MLL4在MIRI后表达上调，且Mll4缺失加剧了MIRI的急性和慢性阶段，包括心肌梗死面积扩大、心肌损伤标志物升高、凋亡增加、心脏功能恶化、纤维化加重和线粒体结构损伤。在体外，新生大鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs）中Mll4敲低加重了缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）诱导的氧化应激、线粒体功能障碍和凋亡。通过整合靶向裂解与标记测序（CUT&Tag-seq）和RNA测序（RNA-seq），研究人员发现Mll4缺失导致Stat3基因内含子增强子区域H3K4单甲基化（H3K4me1）和组蛋白H3赖氨酸27乙酰化（H3K27ac）富集显著减少。机制上，MLL4作为Stat3的转录激活因子，通过沉积H3K4me1和H3K27ac促进STAT3转录，进而维持STAT3依赖的线粒体稳态。功能实验证实，MLL4过表达增强STAT3表达，减轻H/R诱导的心肌细胞凋亡；而STAT3抑制或敲低逆转了MLL4过表达的保护作用，STAT3过表达则挽救Mll4缺失导致的线粒体功能障碍和凋亡。这些发现首次将MLL4鉴定为MIRI的关键表观遗传调控因子，通过STAT3介导的线粒体功能发挥保护作用，为MIRI治疗提供了新的潜在靶点。该论文发表在《Redox Biology》。

**主要关键技术方法**

1. **动物模型**：利用Tnnt2-rtTATetO-Cre系统构建心肌细胞特异性Mll4敲除（Mll4-cKO）小鼠，通过左前降支冠状动脉（left anterior descending coronary artery, LAD）结扎建立体内缺血再灌注（I/R）模型。
2. **细胞模型**：分离新生大鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes, NRCMs）和H9c2细胞系，进行缺氧/复氧（H/R）处理。
3. **表观基因组分析**：采用靶向裂解与标记测序（CUT&Tag-seq）检测H3K4me1和H3K27ac在全基因组的分布；利用RNA测序（RNA-seq）分析基因表达变化。
4. **基因操作**：通过CRISPR/Cas9系统（协同激活介质，synergistic activation mediator, SAM）进行MLL4过表达；使用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）沉默Stat3；通过慢病毒介导的sgRNA敲低Mll4。
5. **表型分析**：超声心动图评估心脏功能；Evans blue/TTC染色评估心肌梗死面积；TUNEL染色和流式细胞术检测凋亡；透射电子显微镜观察线粒体超微结构；JC-1染色检测线粒体膜电位；MitoTracker染色观察线粒体形态；免疫荧光和免疫印迹检测蛋白表达。
6. **生物信息学分析**：整合CUT&Tag-seq和RNA-seq数据，利用HOMER、MACS2、IGV等工具进行峰识别、基序分析和基因组可视化。

**研究结果**

**3.1 MLL4在MIRI和H/R处理的NRCMs中上调**
通过分析公开数据集（CRA008354和GSE46224），发现MIRI小鼠心脏组织中H3K4me1和H3K27ac水平显著升高，且缺血性心肌病（ischemic cardiomyopathy, ICM）患者心肌组织中MLL4（KMT2D）mRNA上调。体内I/R模型和体外H/R处理均证实MLL4蛋白表达升高。

**3.2 心肌特异性Mll4敲除促进小鼠急性MIRI**
Mll4-cKO小鼠在I/R后血清磷酸肌酸激酶（CK）、CK-MB和乳酸脱氢酶（LDH）水平显著升高，心肌梗死面积增大，TUNEL阳性细胞和Cleaved-caspase3蛋白水平增加，表明MLL4缺失加剧急性心肌损伤。

**3.3 MLL4缺失加重心脏功能障碍和线粒体损伤**
在I/R后28天，Mll4-cKO小鼠出现左心室射血分数（EF%）和短轴缩短率（FS%）降低、左心室舒张末期容积（LVEdV）和收缩末期容积（LVEsV）增加、E/A比值升高（舒张功能障碍加重）、心肌纤维化面积增大。透射电子显微镜显示线粒体形态异常（长度缩短、横截面积减小），TOMM20（线粒体外膜标志物）表达降低。

**3.4 抑制MLL4加重体外心肌细胞凋亡**
在H/R处理的Mll4敲除NRCMs和H9c2细胞中，ROS生成增加、丙二醛（MDA）释放升高、线粒体膜电位（MMP）丧失（JC-1染色红色荧光减少、绿色荧光增多）、TOMM20表达下降且信号分散，以及凋亡率升高（流式细胞术）和抗凋亡蛋白BCL-XL下调。

**3.5 抑制MLL4重塑NRCMs的染色质景观和基因表达谱**
CUT&Tag-seq显示Mll4敲低导致H3K4me1差异峰（主要下调）集中在基因启动子和远端非编码区，相关基因富集在凋亡、细胞周期和转录调控等生物学过程。RNA-seq和GSEA分析表明Mll4缺失上调ROS和氧化应激相关通路，下调线粒体功能和超氧化物代谢通路。基序分析发现STAT3是富集峰相关的转录因子之一。

**3.6 MLL4通过结合Stat3内含子增强子调控心肌细胞中Stat3转录**
CUT&Tag-seq显示MLL4直接结合Stat3基因位点，Mll4敲低减少该位点H3K4me1和H3K27ac富集。荧光素酶报告实验证实Stat3基因内含子区域（En-2片段）具有增强子活性。Mll4-cKO小鼠心脏中STAT3和p-STAT3（Tyr705）蛋白水平降低，p-STAT3核转位减少。时间进程分析表明Mll4转录激活早于或平行于Stat3。

**3.7 MLL4过表达增强STAT3表达并减轻心肌细胞凋亡**
利用CRISPR/dCas9 SAM系统在NRCMs中过表达MLL4，导致STAT3蛋白上调，Cleaved-caspase3减少，H/R诱导的凋亡减轻（流式细胞术），MitoTracker染色显示线粒体结构损伤改善。STAT3激动剂Colivelin可缓解Mll4敲低导致的凋亡。

**3.8 STAT3抑制消除MLL4过表达的保护效应**
在MLL4过表达的NRCMs中，沉默Stat3（siRNA）逆转了MLL4过表达对ROS、MDA、凋亡和凋亡相关蛋白（BAX、Cleaved-caspase3）的抑制作用。Stat3过表达则挽救Mll4敲低导致的线粒体功能障碍和凋亡。

**讨论与结论**

**讨论总结**：本研究首次揭示了MLL4在成年心脏MIRI中的保护作用。MLL4通过表观遗传机制调控Stat3转录：MLL4作为组蛋白甲基转移酶，在Stat3基因内含子增强子区域沉积H3K4me1和H3K27ac，激活Stat3转录，促进STAT3蛋白表达和核转位，从而维持线粒体稳态、抑制心肌细胞凋亡，减轻MIRI。时间进程分析表明MLL4是MIRI应激下的早期转录启动因子。尽管MLL4在胚胎心脏发育中不可或缺，本研究将其功能扩展至成年心脏损伤修复，提示MLL4可能作为MIRI和心力衰竭的预后生物标志物，且开发MLL4特异性小分子激动剂具有治疗转化潜力。

**研究结论**：总之，研究人员首次证明MLL4通过其表观遗传调控功能，作为STAT3的转录激活因子，通过H3K4me1促进Stat3转录和核积累，从而维持线粒体功能、抑制心肌细胞凋亡，在MIRI中发挥保护作用。作为关键的表观遗传调控因子，MLL4主要通过激活增强子控制基因表达和细胞命运。MLL4功能缺失突变是多种癌症和歌舞伎综合征（Kabuki syndrome）的重要驱动因素。既往研究确立了MLL4在胚胎心脏发育中的必要性，而本研究将其重要性延伸至成年心脏的损伤修复过程，证明MLL4也是成年心肌细胞抵抗MIRI的关键保护因子。未来，监测心肌组织中MLL4的表达或活性可能作为MIRI和心力衰竭的预后生物标志物，促进临床疾病管理。此外，开发或筛选MLL4特异性小分子激动剂可能是一个具有转化潜力的治疗方向。本研究为MLL4在MIRI中的功能提供了新认识，提示其作为治疗干预的潜在靶点。