通过生物转化产生的10种未鉴定的石胆酸衍生物及其抗神经炎症活性

《Steroids》：Ten undescribed derivatives of lithocholic acid produced by biotransformation and their anti-neuroinflammatory activity

　　

摘要

通过Aspergillus minisclerotigenes的生物转化，得到了10种尚未被描述的石胆酸羟基化、乙酰化、酯化和糖苷化衍生物，以及4种已知化合物。结构鉴定采用核磁共振波谱、高分辨率电喷雾质谱和X射线晶体学技术。生物学评估显示，化合物10能显著抑制BV2小胶质细胞中LPS诱导的一氧化氮生成（IC₅₀为4.67 μM），并且还能剂量依赖性地降低IL-1β、TNF-α、iNOS和COX-2的mRNA表达水平。此外，化合物10还能促进LPS激活的小胶质细胞向M2极化，从而减轻神经炎症。进一步分析表明，该化合物可诱导BV2细胞中的炎症性自噬。这些结果说明，生物转化是一种有效的策略，可用于实现石胆酸的结构多样化，并发现具有强效抗炎作用的候选物质。

引言

在传统中医中，牛黄、熊胆和猪胆等源自胆汁的动物制品因其数千年来所展现的治疗功效而被视为重要的药用资源[1]、[2]。胆汁酸是其中主要的生物活性成分，包括胆酸、熊去氧胆酸、脱氧胆酸和石胆酸。它们在机体生理调节中发挥着关键作用，尤其是在中枢神经系统功能方面[3]、[4]。胆汁酸代谢紊乱与阿尔茨海默病、抑郁症和多发性硬化症等神经系统疾病日益相关，脑组织和脑脊液中也观察到了胆汁酸谱型的变化[5]、[6]。值得注意的是，某些特定的胆汁酸能够穿过血脑屏障，从而直接调控神经元和胶质细胞的活性、突触可塑性以及神经炎症反应[7]。这些特性使得胆汁酸具有潜在的神经保护作用和调节功能，将传统应用与现代神经科学相结合，为基于胆汁酸药理学的针对中枢神经系统的疗法提供了新的发展方向。

除了自身的生物活性外，胆汁酸的结构多样性也为药物开发带来了巨大机遇。科学家们尤其关注从价值较低的胆汁酸出发合成的羟基化衍生物，因为通过针对性的分子修饰，这类衍生物往往具有更强的治疗潜力[8]、[9]。然而，目前合成具有显著药理作用的胆汁酸衍生物仍然面临诸多挑战，现有研究也证实了这一困难。其主要限制包括：需要经过复杂的多步骤反应，过程中会产生具有细胞毒性的中间体；在羟基化反应过程中，为了精确控制区域化学结构和立体化学性质，往往需要反复进行保护基团的操作；此外，还需要对甾体框架进行结构改造[10]。

生物转化是一种在有机合成中应用极为广泛的方法，其特点是具备极高的化学选择性、区域选择性和立体选择性[11]、[12]。这种方法大大简化了结构复杂的有机分子的构建过程。此外，天然产物的酶法修饰也是当前研究热点，尤其在新型药物衍生物的开发方面发挥着重要作用[13]、[14]。

石胆酸被认为是一种价值较低的胆汁酸，但它具有多种已知的药理活性，包括抗病毒、抗炎、抗衰老和抗肿瘤作用[15]、[16]、[17]。不过，由于其较高的疏水性和已知的细胞毒性，其在临床上的应用受到了很大限制。因此，研究人员们开始利用石胆酸作为分子骨架，通过化学合成和生物转化方法对其结构进行改造[18]、[19]。这些方法有效地提升了该化合物的物理化学性质和生物活性，从而增强了其作为潜在治疗药物的可行性。

在本研究中，我们探讨了Aspergillus minisclerotigenes CGMCC 3.86菌株对石胆酸的微生物转化作用。通过该转化过程，我们得到了10种此前未被报道的羟基化、乙酰化、酯化和糖基化衍生物，以及4种已知化合物。我们在LPS刺激的BV2小胶质细胞中评估了所有衍生物的抗神经炎症活性，并研究了相关的作用机制。

章节摘录

实验方法和试剂

实验方法遵循以往研究的成熟方案[11]。所使用的真菌菌株A. minisclerotigenes CGMCC 3.86是从中国微生物菌种保藏管理中心获取的。石胆酸（纯度大于98%）则购自上海阿拉丁生化科技有限公司。

生物转化与分离

筛选试验规模和大规模生物转化流程与我们之前的研究相同[12]、[14]。大规模生物转化是在容量为1升的埃伦迈尔烧瓶中进行的，每个烧瓶中加入400毫升反应液

结构解析

通过生物转化过程，我们分离出了10种尚未被描述的化合物（编号为3–5和8–14），以及4种已知化合物（编号为1、2、6和7）（见图1）。

化合物3以白色粉末的形式被分离出来，根据高分辨率电喷雾质谱中m/z为457.2932的M＋^Na+离子峰，确定其分子式为C₂₆H₄₂O₅（按C₂₆H₄₂O₅Na计算时，理论值应为457.2930）。其¹H核磁共振谱图与石胆酸相比存在明显差异，其中特征性的H-3质子信号的出现位置向低场移动，δ值约为

结论

在本研究中，通过A. minisclerotigenes对石胆酸的生物转化，我们分离并鉴定了14种石胆酸衍生物，其中包括10种新发现的衍生物和4种已知衍生物。这些衍生物主要是在C-6β和C-15α位点发生羟基化、乙酰化和糖基化反应而形成的。此外，大多数衍生物的抗神经炎症活性都强于石胆酸本身。其中化合物10对LPS诱导的一氧化氮生成具有最强的抑制作用

作者贡献说明

Chenhua Wang：负责初稿撰写、方法设计和实验研究。Gang Chen：参与初稿撰写、方法设计和实验研究。Wen Xu：负责方法设计工作。Hossain M.D. Shohag：负责数据整理工作。Alam Kazi M.D. Iftakhar：负责数据整理工作。Huilian Huang：负责论文审阅与编辑、项目监督以及资金申请工作。Guangtong Chen：负责论文审阅与编辑、项目管理工作以及资金申请工作。

利益冲突声明

所有作者均声明，他们不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本项研究得到了国家自然科学基金（项目编号：82560828）、江西中医药大学开放基金项目（项目编号：Zdsys-202402）以及江西中医药大学科技创新团队发展计划（项目编号：CXTD22002）的资助。

Chenhua Wang|Gang Chen|Wen Xu|Hossain M.D. Shohag|Alam Kazi M.D. Iftakhar|Huilian Huang|Guangtong Chen

中国江西省南昌市330004，江西中医药大学，教育部中药现代制剂重点实验室