编码p7的mRNA-LNP丙型肝炎疫苗诱导增强的体液免疫原性

《Vaccine》：mRNA-LNP hepatitis C vaccine encoding p7 elicits improved humoral immunogenicity

　　

核苷修饰信使RNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）疫苗对针对传染性病原体的疫苗开发产生了巨大影响，尤其是在COVID-19大流行开始之后。由于mRNA和LNP组分的独特特性，该平台是体液和细胞免疫应答的有效刺激剂。研究人员旨在优化mRNA-LNP平台针对特定病毒靶标的性能，开发一种针对丙型肝炎病毒（HCV）的疫苗，以改善HCV样颗粒（HCV-like particle）的分泌并增强体液免疫应答。研究人员设计了一种靶向HCV的mRNA-LNP疫苗，并通过包含非结构HCV病毒孔蛋白p7提高了其效力，并在免疫小鼠中测量了细胞和体液免疫应答。两种构建体均诱导了抗原特异性功能性CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答，以及与体液免疫相关的滤泡辅助T细胞（Tfh）应答，这与mRNA-LNP平台的其他应用一致。与未优化的构建体相比，用优化构建体免疫的小鼠显示出更强的结合抗体和中和抗体应答。值得注意的是，优化构建体针对异源病毒株引发了更强的体液应答。研究人员的发现强调了mRNA-LNP疫苗对HCV的潜力，但将这些发现转化为人类需要进一步研究。这些结果证明了通过包含具有超出呈现靶向病原体表位之外用途的元件来优化mRNA-LNP平台的价值。这项研究推动了HCV疫苗开发，并扩展了mRNA-LNP平台针对传染病的应用。

丙型肝炎病毒（HCV）感染全球约5000万人，慢性感染可导致肝衰竭和肝癌，尽管有治愈性疗法，但仅靠治疗难以消除，因知晓率低且治疗可及性有限。疫苗开发面临快速突变、抗原多样性和缺乏免疫竞争动物模型等挑战。先前研究提示自发性清除与早期诱导广谱中和抗体（bNAbs）相关，而针对结构蛋白的病毒样颗粒（VLP）可能呈现构象表位，增强体液应答。mRNA-LNP平台因能刺激强效体液和细胞免疫而备受关注，但针对HCV的优化尚需探索。本研究旨在通过纳入非结构蛋白p7增强VLP分泌和体液免疫原性。

研究人员设计了两种编码HCV结构蛋白C、E1、E2（CE1E2）的mRNA-LNP构建体，一种包含p7（CE1E2p7），另一种不含。在Expi293F细胞中验证表达和VLP分泌，并在BALB/c小鼠中评估免疫应答。结果显示，CE1E2p7构建体显著提高细胞内蛋白表达（4.5倍）和分泌（5倍），并增强VLP产量。两种构建体均诱导类似水平的Tfh细胞、CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答，但CE1E2p7组在结合抗体和中和抗体滴度上显著更高，且对异源HCV株的广谱性更强。该研究首次证明mRNA-LNP VLP疫苗对HCV的潜力，并强调p7在优化体液免疫中的价值。论文发表在《Vaccine》。

主要关键技术方法包括：mRNA生产（基于质粒编码密码子优化序列，体外转录并纯化，LNP包封，粒径81-84 nm，包封率>96%）；细胞培养与转染（Expi293F细胞，血清-free培养基）；Western blot检测C、E1、E2蛋白；HCV核心抗原ELISA定量；负染电子显微镜（NSEM）观察VLP；小鼠免疫（BALB/c小鼠，6-8周龄，皮内或肌肉注射）；Tfh细胞检测（流式细胞术，标记B220、CD4、PD-1、CXCR5、Bcl6等）；多功能T细胞分析（脾细胞经E1/E2肽库刺激，细胞内染色CD3、CD4、CD8、TNF-α、IFN-γ、IL-2）；E1E2结合ELISA（使用HEK293T-ΔCD81细胞产生的E1E2裂解液，含变性条件）；HCV假颗粒（HCVpp）中和实验（基于同源和异源E1E2序列，血清稀释测定ID₅₀）。样本来源：BALB/c小鼠，由University of Pennsylvania动物设施提供。

**3.1. 参与者的病毒基因编码在mRNA中，从转染细胞中表达**
两种mRNA构建体（CE1E2和CE1E2p7）在Expi293F细胞中表达预期大小的蛋白（C、E1、E2），p7未直接检测（因缺乏抗体）。细胞内蛋白表达在24小时达到峰值，通过Western blot证实。

**3.2. mRNA构建体诱导VLP分泌，并因包含p7而增强**
CE1E2构建体转染细胞后，NSEM观察到直径约20 nm的VLP。CE1E2p7构建体相比CE1E2，细胞内蛋白表达增加4.5倍，分泌增加5倍（ELISA定量HCV核心抗原）。NSEM显示CE1E2p7组VLP数量更多，支持p7增强VLP分泌的假设。

**3.3. mRNA-LNP疫苗诱导相关细胞应答**
两种mRNA-LNP构建体（10 μg，肌肉注射）均诱导高水平Tfh细胞（相比空LNP对照），但两者间无显著差异。使用3 μg剂量加强后，两种构建体均诱导E2特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞产生Th1型细胞因子（IFN-γ、TNF-α、IL-2），p7未影响T细胞应答。

**3.4. mRNA-LNP疫苗诱导结合和中和抗体，且因包含p7而增强**
皮内免疫（10 μg，三次）后，两种构建体均产生针对同源株1a53的结合抗体和中和抗体。CE1E2p7组结合滴度（均值4.00×10⁴）显著高于CE1E2组（1.49×10⁴），中和ID₅₀（log10均值2.601）也显著高于CE1E2组（1.968）。

**3.5. mRNA-LNP疫苗接种诱导广谱反应性中和抗体应答，且p7增强广谱结合抗体**
针对异源株1a157（氨基酸同源性90.99%），CE1E2p7组结合抗体显著高于CE1E2组。变性ELISA显示CE1E2p7组构象表位结合更强。针对17株抗原性多样化HCV株的ELISA表明，CE1E2p7组结合广度显著优于CE1E2组（p=0.0237）。中和实验显示，CE1E2p7组对异源株1a157的中和滴度更高（趋势，p=0.08），且对多样化HCVpp的血清池中和效力更强（但未统计推断）。

讨论部分指出，这是首次证明mRNA-LNP VLP疫苗对HCV，p7通过增强VLP分泌和构象表位展示提升体液免疫。两种构建体诱导相似的T细胞应答，符合预期。mRNA-LNP平台的长时抗原表达和LNP佐剂效应可能促进强效体液应答。局限包括缺乏免疫竞争动物模型验证保护效力，以及中和广度比较因样本量受限。研究结论翻译如下：在这项工作中，研究人员首次证明了一种针对HCV的核苷修饰mRNA-LNP VLP疫苗，该疫苗能够诱导相关抗原特异性功能性细胞应答，并针对多种HCV变异株产生强效结合和中和抗体应答。该研究代表了HCV疫苗开发的重大进展，并推进了mRNA-LNP疫苗平台在传染病中的应用。