超越中和作用：评估减毒四价登革热疫苗诱导的体液免疫的全面框架

《Vaccine》：Beyond neutralization: A comprehensive framework for evaluating humoral immunity induced by a live-attenuated tetravalent dengue vaccine

　　摘要
目的：全球范围内登革热发病率正在上升。TAK-003是一种减毒活的四价登革热疫苗，已在多个国家获得批准。其安全性、有效性及免疫原性已经过广泛研究，为相关建议和实施提供了依据。根据世界卫生组织的指南，登革热疫苗临床试验中的主要免疫原性指标是中和抗体滴度。然而，目前尚无明确的保护作用免疫学标志物，且登革病毒能引发多种不同的抗体反应。本研究旨在评估用于分析TAK-003所引发的各类抗体反应的统计与实验方法，以此作为识别可能与登革热感染及疾病防护相关的疫苗免疫学特征的基础。

方法：通过以下免疫测定方法检测免疫反应：微中和试验、登革热病毒总结合IgG ELISA检测、抗登革热补体抗体检测、抗登革热非结构蛋白1 IgG ELISA检测以及抗登革热IgG亲和力检测。对多项试验中接种TAK-003疫苗或接受安慰剂的受试者样本进行了检测。比较了各检测方法的性能，以及基线血清状态、血清型及年龄对疫苗诱导反应的影响。通过相关性分析探究变量间的关联关系，还运用主成分分析来评估数据复杂性。

结果：在各项检测中，疫苗接种均引发了针对四种登革热病毒血清型的免疫反应。基线血清阳性受试者的疫苗诱导反应强度更高，而基线血清阴性受试者的疫苗效果更为显著。基线血清阴性的受试者在所有血清型中，登革热病毒总结合IgG浓度、抗登革热IgG亲和力及抗登革热补体抗体滴度水平相当。MNT50中和抗体水平及抗登革热NS1 IgG反应则因血清型而异。各参数之间的相关性较低，表明这些不同的检测方法所测定的为互不重复的疫苗诱导体液免疫反应。影响反应差异的主要因素是接种后时间，其次是血清型。

结论：TAK-003疫苗接种可引发多种互不重叠的独特体液免疫反应。现有数据支持在评估疫苗诱导的体液免疫反应时，除中和抗体外还应考虑其他指标。

ClinicalTrials.gov注册号：NCT01511250、NCT02302066、NCT02747927、NCT03423173

引言
全球范围内登革热的负担日益加重。每年有高达4亿人次感染登革热病毒，约1亿人出现症状性疾病[1][2]。该病毒现已在100多个热带和亚热带国家流行[1][2][3]。虽然重症登革热较为罕见[2]，但它仍会给健康和经济发展带来巨大压力[1]。要有效控制登革热，必须采取包括疫苗接种在内的综合措施。

感染四种登革热病毒血清型中的任何一种都可能仅表现为无症状或轻微的类似流感的症状，但也可能引发严重疾病，有时甚至致命，且往往缺乏明确的免疫学预测因素[4][5][6]。由于影响疾病严重程度的因素众多，包括感染的病毒株和血清型、个体的年龄与遗传背景，以及此前对登革热或其他黄病毒的抗体会不会存在等[1][7]，因此对重症登革热的成因分析十分复杂。此外，某些免疫学因素，如继发感染中的抗体依赖性增强现象[7][8]、先天免疫功能紊乱、细胞因子风暴、交叉反应性T细胞[9]、非结构蛋白1介导的内皮损伤[8]以及肥大细胞活化[10]，也会在初次感染登革热时，尤其是在继发感染不同血清型的登革热时，促使病情加重[1][6]。

根据世界卫生组织的指南，对减毒活四价登革热疫苗的临床评估应包括安全性、预防登革热疾病的保护效果，以及对四种登革热病毒血清型的免疫反应情况[11]。中和抗体水平常被用作评估疫苗免疫原性的指标，但目前尚未确定适用于不同人群、不同地区，尤其是针对所有四种登革热血清型的统一免疫学保护标志物或阈值[11]。由于四种登革热病毒血清型在抗原性上存在差异，且先前感染某一血清型可能会影响对其他血清型的免疫反应，因此解析登革热免疫机制十分复杂。此外，中和抗体仅代表登革热暴露后引发的体液免疫反应中的一小部分。来自登革热流行地区的观察性流行病学研究显示，除了中和抗体之外，抗登革热IgG的亲和力与结合力、中和抗体的表位特异性、非中和性效应功能，以及针对登革热非结构蛋白的抗体，也可能有助于减轻后续登革热感染的严重程度[4][12][13][14]。因此，探索多种免疫反应指标对于全面了解登革热疫苗的免疫原性具有重要意义[15]。

TAK-003（Qdenga?）是一种重组减毒活四价登革热疫苗，适用于有过或没有登革热感染史的人群[16]。该疫苗以减毒后的DENV-2病毒株作为基因骨架，这一株系因其良好的减毒效果、较低的诱发性反应以及均衡的免疫原性而被选中。减毒后的DENV-2为编码DENV-1、DENV-3和DENV-4结构基因的重组病毒提供了基因基础[17]。这种设计旨在激发针对所有四种登革热病毒血清型的强大免疫反应。经过大量的临床前研究和临床试验后，最终开展了关键的III期DEN-301试验（TIDES，NCT02747927）。在该试验中，TAK-003成功达到了主要研究目标，显示出在12个月内对病毒学确诊的登革热具有80.2%的疫苗效力（95%置信区间为73.3%~85.3%），且其保护效果可维持约7年之久[18][19][20][21]。此外，在2024年巴西出现以DENV-1和DENV-2为主的疫情期间，针对青少年开展的全国性疫苗接种活动也表明，TAK-003能有效降低症状性疾病的发病风险（接种第二剂后的保护效率为61.7%，95%置信区间为39.9%~75.6%）[22]。目前，TAK-003已在亚太地区、欧洲、拉丁美洲和中东的40多个国家获得使用许可，同时也被纳入阿根廷的国家免疫计划中，用于大规模接种[23]。对II期试验（DEN-204[24][25][26]）以及III期试验（DEN-301和DEN-304；详见补充表1）中受试者血清样本的免疫原性分析表明，无论受试者基线是否为登革热血清阳性，疫苗接种都能在其体内产生持久的中和抗登革热抗体反应。不过，按血清型和血清状态划分时，针对每种登革热病毒血清型的中和抗体反应并不总能与疫苗对病毒学确诊登革热的保护效果相对应[19]。

本研究旨在运用定量、基于数据的分析框架，系统分析TAK-003疫苗接种所引发的各类体液免疫反应，从而了解这些反应的动态变化规律，并识别出在不同登革热病毒血清型及不同基线血清状态的人群中，具有潜在保护作用的免疫学标志物，进而确定其重要性。

检测方法筛选标准
我们对各种适合用于检测针对登革热病毒1型、2型、3型和4型E蛋白以及NS1蛋白的多种体液免疫反应的强度和/或功能性的免疫测定方法进行了评估[12][14][27][28]。这些检测方法需满足以下标准，才能与经过验证的临床终点指标——微中和试验相媲美：
1. 能够检测体液免疫反应的某一独特方面；
2. 错误阳性率低；
3. 具有较宽的动态检测范围；
4. ……

TAK-003引发的体液免疫反应评估
我们首先通过描述性分析及混合效应线性模型，评估了疫苗诱导的免疫反应的强度及其持续时间，以此判断这些反应随时间相对于基线水平的变化情况。在所有研究中，无论受试者基线是否为登革热血清阳性，TAK-003接种后，在五种选定检测方法所检测的所有免疫学指标上，都会引发显著高于基线水平的四价体液免疫反应（见图1A）。

讨论
登革热感染会引发分阶段、多方面的免疫反应，包括先天免疫、体液免疫和细胞介导的免疫反应[1][7]。仅凭中和抗体水平并不能作为判断保护作用的可靠免疫学指标，也无法完全预测后续登革热感染的结局，更无法全面反映感染或疫苗接种所引发的复杂免疫反应[19][31]。抗体种类繁多，可根据靶标蛋白和表位、免疫球蛋白类别、亚类、结合亲和力及亲和力强度等进行分类。

CRediT作者贡献说明
Raphael Gottardo：撰写——审阅与编辑、可视化、软件应用、方法设计、正式分析、数据整理、概念构建。
Hansi Dean：撰写——审阅与编辑、项目监督、资源协调、资金筹集、概念构建。
Eduardo J.M. Nascimento：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、研究实施、概念构建。
Vianney Tricou：撰写——审阅与编辑、项目监督、研究实施。
Mayuri Sharma：撰写——审阅与编辑、初稿撰写。

资金支持
本研究由美国马萨诸塞州剑桥市的武田制药公司资助。武田公司参与了本研究的设计、数据收集、分析与解读，还参与了手稿的撰写以及决定将文章投稿发表。

利益冲突声明
作者们声明存在以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：Raphael Gottardo表示获得了武田制药公司的财政支持；Hansi Dean同样表示得到了武田制药公司的财政支持；Eduardo J.M. Nascimento也表示获得了武田制药公司的财政支持；Vianney Tricou也表示得到了武田制药公司的财政支持；Mayuri Sharma也表示获得了武田制药公司的财政支持。

致谢
医学写作方面的支持来自Envision Pharma Group旗下Envision Catalyst公司的Amrita Ostawal和Leonie Huitema博士，相关工作得到了瑞士苏黎世武田制药国际公司的资助。

术语表
CFA：补体结合抗体；CI：置信区间；DENV：登革热病毒；ELISA：酶联免疫吸附试验；Ig：免疫球蛋白；MBC：记忆B细胞；MNT：微中和试验；NAb：中和抗体；NS1：非结构蛋白1；PC：主成分；PCA：主成分分析；SE：标准误差；VCD：病毒学确诊的登革热；VE：疫苗效力。

Raphael Gottardo | Hansi Dean | Eduardo J.M. Nascimento | Vianney Tricou | Mayuri Sharma
洛桑大学医院生物医学数据科学中心，洛桑大学，瑞士洛桑市1011号