《Vaccine》：Adjuvant properties of baculovirus enhance the immunogenicity and protective efficacy of foot-and-mouth disease virus-like particles vaccines in mice
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摘要口蹄疫是全球最具经济影响的家畜疾病之一，其病原体口蹄疫病毒传播迅速，且疫情爆发会带来严重经济损失。基于病毒样颗粒的疫苗是传统灭活疫苗的安全替代品，但它们的免疫原性有限，这一缺陷仍需解决。杆状病毒天然感染昆虫，在脊椎动物体内无法复制，却具有很强的免疫刺激作用，可作为疫苗佐剂。在
摘要
口蹄疫是全球最具经济影响的家畜疾病之一，其病原体口蹄疫病毒传播迅速，且疫情爆发会带来严重经济损失。基于病毒样颗粒的疫苗是传统灭活疫苗的安全替代品，但它们的免疫原性有限，这一缺陷仍需解决。杆状病毒天然感染昆虫，在脊椎动物体内无法复制，却具有很强的免疫刺激作用，可作为疫苗佐剂。在本研究中，我们设计了以口蹄疫病毒样颗粒为载体、杆状病毒作为佐剂的疫苗策略，并在鼠模型中评估了其免疫反应。研究成功在昆虫蛹中制备出口蹄疫病毒样颗粒，并通过西方印迹试验、透射电子显微镜及ELISA技术对其进行了鉴定。将杆状病毒与口蹄疫病毒样颗粒联合使用后，能显著增强体液免疫反应，产生的抗体水平高于单独使用病毒样颗粒的情况。此外，接种疫苗的动物在病毒感染后表现出部分保护作用，临床症状减轻，体重保持较好，存活率也高于对照组。进一步的树突状细胞体外研究表明，杆状病毒是该疫苗配方中主要的免疫刺激成分，能够促进细胞活化。总体而言，这些研究结果支持将杆状病毒用作口蹄疫病毒样颗粒疫苗的佐剂，以提高免疫原性并在这项鼠模型研究中实现部分保护效果。这些发现表明，该技术平台有望成为开发更安全、更具成本效益的兽医疫苗的理想方案。
引言
口蹄疫是一种高度传染性的病毒性疾病，主要感染偶蹄类动物，由于会导致生产力下降以及限制受感染地区动物及其产品的贸易，给全球带来了巨大经济损失[1]、[2]。口蹄疫的防控依赖于卫生措施，以及在病毒可能传播的地区对易感动物进行系统接种。
该病的病原体是口蹄疫病毒，属于小RNA病毒科口疮病毒属。这种病毒颗粒呈二十面体结构，内部包含约8200个核苷酸长的单链正链RNA基因组，该基因组编码一个多蛋白，随后会被切割成结构蛋白和非结构蛋白[3]。口蹄疫病毒共有7种抗原性不同的血清型（A、O、C、亚洲1型、SAT1、SAT2和SAT3），每种血清型又包含多个亚型，这些亚型能引发相应的中和抗体，不同血清型甚至不同亚型之间不存在交叉保护作用[4]、[5]。
目前常用的灭活病毒疫苗在控制口蹄疫方面效果显著[6]，但也存在一些局限性。其中一个主要问题是需要经过复杂的纯化流程，去除可能存在的非结构病毒蛋白，这样才能区分感染动物和已接种疫苗的动物[7]。此外，疫苗的生产需要在灭活前大量扩增和处理具有感染性的病毒，这不仅要求严格的生物安全措施，还会增加生产成本，因为在无疫地区尤其需要高防护级别的设施[8]。
在这种情况下，病毒样颗粒为开发新一代疫苗提供了创新思路[9]。病毒样颗粒能够模拟天然病毒的结构特征，保留有效诱导免疫反应所需的关键抗原决定簇，同时不含病毒遗传物质，因此不会带来感染风险。其重组生产方式提高了安全性，还能实现灵活、可规模化且成本较低的制造工艺。而且，生产和最终疫苗配方中都不含感染性病毒，这有利于获得监管机构的批准以及在国际上被接受，尤其是在那些限制使用灭活全病毒疫苗的国家[10]。
重要的是，基于病毒样颗粒的疫苗能够快速重新设计抗原，以应对新出现的疫情，这对于像口蹄疫病毒这类抗原多样性高的病毒来说尤为重要，因为这类病毒的致病机制和免疫逃逸能力十分复杂，给设计广谱疫苗带来了很大难度[11]。不过，由于病毒样颗粒不含病毒核酸，若没有额外的免疫刺激信号，它们可能无法充分激活先天免疫反应[12]。因此，加入合适的佐剂是提升病毒样颗粒诱导的免疫反应强度和质量的合理策略，而杆状病毒就是一种极具前景的新型佐剂选择。
杆状病毒属于杆状病毒科，是一类仅感染昆虫的双链DNA病毒[13]。除了被广泛用作重组表达系统外，杆状病毒还具有天然的免疫刺激作用，能够通过激活先天免疫途径发挥天然佐剂的功能[14]、[15]。由于杆状病毒并非哺乳动物的天然病原体，它们并未进化出逃避哺乳动物免疫识别机制的能力。因此，当它们被宿主的模式识别受体识别时，包括DNA感应通路在内，就会触发强烈的先天免疫反应。
这种免疫反应主要是由树突状细胞、巨噬细胞、上皮细胞以及其他先天免疫细胞类型中表达的先天免疫受体感知杆状病毒DNA所引发的[16]。由于杆状病毒基因组中未甲基化的CpG序列含量较高，它们能够通过内体途径和胞质DNA感应途径两种方式激活免疫细胞。Toll样受体9识别到这些信号后会触发MyD88依赖的信号传导通路，进而产生促炎细胞因子和I型干扰素[17]。此外，杆状病毒DNA还能激活胞质DNA传感器，包括STING通路，进一步促进干扰素的生成和先天免疫的激活。在树突状细胞中，越来越多的证据表明TTL9依赖的通路和STING依赖的通路之间存在功能交互，二者共同调控I型干扰素的产生。总体而言，这些通路能够促进树突状细胞的活化与成熟，进而提升抗原呈递能力，推动抗原特异性适应性免疫反应的产生[16]。
有趣的是，先前的研究显示，利用杆状病毒-昆虫表达系统生产的口蹄疫病毒空衣壳疫苗在牛群中的保护效果非常好[18]、[19]、[20]。不过，这些研究并未专门分析昆虫来源的制剂中杆状病毒颗粒所发挥的免疫刺激作用。因此，杆状病毒相关的先天免疫激活在疫苗效果中起到了多大作用，目前尚不清楚。
综合以上情况，我们有充分的理由将本身不含有病原体相关分子模式的内源病毒样颗粒抗原与杆状病毒结合使用，后者可以作为免疫刺激信号来源，通过强大的先天免疫激活作用提升适应性免疫反应。
在本研究中，我们旨在探究杆状病毒作为佐剂是否能够弥补口蹄疫病毒样颗粒自身先天免疫刺激作用不足的问题，从而在鼠模型中提升疫苗的免疫原性和保护效果。
内容节选
细胞系
本研究使用的Sf9昆虫细胞系为第25至33代细胞（来自美国马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Fisher Scientific公司），这些细胞在含有10%胎牛血清（来自阿根廷Internegocios公司，FRA等级）以及抗生素-抗真菌溶液（来自Thermo Fisher Scientific公司的Gibco品牌）的Sf-900? II SFM培养基中，于27℃条件下培养。鼠源树突状细胞系JAW II由Cebrián博士提供，用于体外激活实验。JAW II细胞在37℃、湿度适宜的环境中培养
口蹄疫病毒样颗粒的制备与结构鉴定
如“材料与方法”部分所述，重组口蹄疫病毒衣壳蛋白是在感染了重组杆状病毒Ac-P12A3CFS的昆虫蛹中制备的。该杆状病毒载体还包含一个受p10启动子调控的EGFP报告基因（见图1a）。培养4天后，对感染了Ac-P12A3CFS的蛹提取物进行检测，以评估衣壳蛋白的表达情况及其加工过程。西方印迹试验结果显示，其中存在VP0、VP1和VP3蛋白
讨论
在那些畜牧业发达的国家，口蹄疫依然是一个长期存在的威胁，防控该病需要每年投入大量资金开展疫苗接种工作。虽然灭活疫苗效果不错，但其生产过程存在诸多弊端，比如需要大规模处理具有感染性的病毒，这会带来较高的生物安全风险。此外，这种疫苗的生产还需要高防护级别的设施以及复杂的制造工艺。在这种背景下，采用现代
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在撰写本文的过程中，作者们使用了ChatGPT来优化英语语法和文本可读性，同时使用NotebookLM生成图形化摘要。在使用这些工具之后，作者们对内容进行了必要的审阅和修改，并对最终发表文章的内容承担全部责任。
CRediT作者贡献说明
弗洛伦西娅·贝伦·洛博·盖坦：论文撰写——初稿编写、可视化分析、验证、方法设计、实验研究、正式分析、数据整理。罗曼·大卫·冈萨雷斯-莫拉：论文撰写——审稿与编辑、方法设计、实验研究、正式分析。索菲娅·图蒂：方法设计、实验研究。罗伯托·卡洛斯·伊加尔萨：资源提供。乔尔·德米安·阿内奥多·拉罗谢特：资源提供。玛丽亚·克鲁兹·米拉利亚：资源提供、方法设计。丹尼尔·马里亚诺·佩雷斯·菲尔格埃拉：监督指导、资源提供、实验研究、概念构思。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。
致谢
作者感谢阿根廷国家科学技术促进局通过PICT 2021-490项目提供的资金支持，感谢阿根廷国家农牧技术研究院通过I105和I102项目给予的支持，同时也感谢莫雷诺国立大学通过PICyDT 648/2024和PICyDT 44/2023项目提供的资助。此外，作者还要感谢西尔维奥·迪亚斯在动物饲养管理方面的帮助，以及BSL4-WOAH实验室团队在技术支持方面的付出。
Florencia Belén Lobo Gaitán|Román David González-Mora|Sofía Tutti|Roberto Carlos Igarza|Joel Demian Arneodo Larochette|María Cruz Miraglia|Daniel Mariano Pérez Filgueira|Rubén Marrero Díaz de Villegas|Oscar Alberto Taboga|María Inés Gismondi|María Paula Molinari
阿根廷乌林汉姆的农牧生物技术及分子生物学研究所（IABIMO）、兽医与农学科学研究中心（CICVyA）、INTA-CONICET
