《Vaccine》：Protective immunity of lectin-adjuvanted intraperitoneal injection vaccine against
Aeromonas veronii infection in
Oreochromis niloticus
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摘要背景由维罗尼气单胞菌引起的疾病爆发对尼罗罗非鱼的水产养殖构成了严重威胁。基于凝集素的佐剂，如刀豆球蛋白A，可通过刺激先天性和适应性免疫来提高疫苗的效力。本研究评估了通过腹腔注射的、含有刀豆球蛋白A佐剂的福尔马林灭活维罗尼气单胞菌疫苗的免疫保护作用。方法将含有刀豆球蛋白A的灭活
摘要
背景
由维罗尼气单胞菌引起的疾病爆发对尼罗罗非鱼的水产养殖构成了严重威胁。基于凝集素的佐剂，如刀豆球蛋白A，可通过刺激先天性和适应性免疫来提高疫苗的效力。本研究评估了通过腹腔注射的、含有刀豆球蛋白A佐剂的福尔马林灭活维罗尼气单胞菌疫苗的免疫保护作用。
方法
将含有刀豆球蛋白A的灭活维罗尼气单胞菌疫苗通过腹腔注射的方式给予尼罗罗非鱼。通过观察鱼的行为和生理反应来评估安全性。通过溶菌酶、髓过氧化物酶和超氧化物歧化酶检测来评估先天性免疫的激活情况。通过血清IgM水平来测量体液免疫反应。分析鱼头肾脏和脾脏组织中的TCR-β、IgM、MHC-II、CD4以及促炎细胞因子（IL-1β、IL-8）的基因表达情况。通过用活的维罗尼气单胞菌攻击接种过的鱼，并计算相对存活率，来确定疫苗的保护效果。
结果
该疫苗是安全的，未观察到任何不良反应。接种疫苗的鱼只的溶菌酶、髓过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性显著升高，表明其先天性免疫得到增强。血清IgM水平在接种后42天达到峰值，显示出强烈的体液免疫反应。基因表达分析显示，与免疫相关的标志物表达上升，证实了体液免疫（IgM）、促炎细胞因子（IL-1β、IL-8）以及细胞介导的免疫途径（TCR-β、MHC-II、CD4）的激活。在受到病原体攻击后，使用刀豆球蛋白A佐剂的疫苗组的相对存活率最高，为79%，远高于对照组。
结论
这些结果表明，刀豆球蛋白A具有很强的免疫刺激作用，而且该疫苗能够促进尼罗罗非鱼的先天性和适应性免疫。刀豆球蛋白A的佐剂效应提升了疫苗的效力和免疫原性。
引言
与运动性气单胞菌败血症相关的鱼类发病率和死亡率不断增加[1]、[2]，这类病症可由多种气单胞菌引起，包括嗜水气单胞菌[1]、索布里亚气单胞菌[3]、维罗尼气单胞菌[2]等[2]、[4]。这类病原体能够感染多种淡水鱼类，偶尔也会感染海洋鱼类[5]，以及人类[2]、[6]、[7]、[8]。在水产养殖中，这种病原体引发的疾病爆发会造成巨大的经济损失。为控制疾病而大量长期使用抗生素，导致了细菌群体中出现抗菌素耐药性。已有研究表明，多种气单胞菌对多种抗生素具有耐药性，包括氨苄西林、青霉素、利福平、头孢菌素、磺胺类药物以及红霉素[11]。运动性气单胞菌败血症，也被称为致命性出血性败血症，是被认为对水生生物尤其是罗非鱼危害极大的疾病之一[2]、[9]。气单胞菌引发的感染表现形式多样，从急性败血症到亚临床或潜伏性感染都有，这些统称为出血性败血症或运动性气单胞菌败血症[2]、[12]。致命性的出血性败血症会导致养殖的莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼以及齐利罗非鱼出现高死亡率[10]。典型的临床症状包括疖病、外部溃疡、腹部膨胀以及全身性出血病变[9]。这种疾病通常发展迅速，往往会导致鱼类快速死亡。疫苗接种是一种有效的预防策略，能够激发鱼类的先天性和适应性免疫反应。在各种免疫方法中，注射疫苗能够精确控制剂量，因此特别适合用于需要按剂量确定免疫效果的鱼类。尽管在针对气单胞菌的疫苗研发方面已经取得了显著进展——包括DNA疫苗、重组蛋白疫苗以及减毒活疫苗[12]、[13]、[14]，但在水产养殖中，福尔马林灭活的全细胞疫苗效果最为显著。这类疫苗能够有效预防气单胞菌感染，且被认为安全、传统，被广泛用于鱼类健康管理领域[15]、[16]、[17]。凝集素是一种糖蛋白，可作为活性佐剂来提升疫苗的效果。这类蛋白质的作用机制在于它们能够与细胞受体上的碳水化合物结合，从而模拟自然的细胞信号传导路径，引发特定的细胞反应。例如，刀豆球蛋白A能够与T淋巴细胞上的受体结合，触发其活化并释放细胞因子，进而产生后续的免疫调节作用[18]、[19]、[20]、[21]、[22]、[23]、[24]。糖基化配体结合蛋白在所有生物体中普遍存在，可大致分为两类：（1）凝集素；（2）硫酸化糖胺聚糖结合蛋白[25]。凝集素与其配体之间的相互作用主要源于碳水化合物配体手性中心中羟基的空间排列方式，这些羟基会与凝集素蛋白β折叠结构中的芳香族氨基酸残基形成特定结合[26]。此外，范德华力也可能有助于维持这些分子间的相互作用。刀豆球蛋白A和植物血凝素因其多克隆活化特性而被归类为丝裂原。这类分子可作为模式识别受体或T细胞受体的激动剂，从而激活具有不同特异性的淋巴细胞。即使抗原浓度很低，这种广泛的激活也能引发可测量的免疫反应，这表明它们有可能作为疫苗佐剂使用[27]、[28]、[29]、[30]。
在本研究中，我们旨在利用刀豆球蛋白A作为佐剂，开发一种福尔马林灭活的全细胞维罗尼气单胞菌疫苗，以提升疫苗的效果。该疫苗被腹腔注射到尼罗罗非鱼体内，以此评估疫苗所具有的免疫原性和保护效果所带来的非特异性和特异性免疫反应。
章节节选
疫苗的制备
福尔马林灭活的维罗尼气单胞菌（FJ573179）疫苗是按照先前描述的方法[31]稍作修改后制备的。简而言之，首先将维罗尼气单胞菌在胰蛋白胨大豆肉汤中于28℃培养36小时，直到培养液的吸光度OD???达到1.0，此时细菌浓度约为1×10? CFU/mL。随后用0.5%（体积比）的甲醛（Sigma，美国）将细菌悬液灭活，然后在室温下放置过夜。灭活处理完成后，细菌
疫苗的灭活与安全性
该疫苗是通过0.5%的福尔马林进行灭活处理的，之后将制备好的疫苗涂布在TSB琼脂平板上，以检测其是否已被完全灭活。经过72小时的培养后，在涂有疫苗的平板上未发现任何菌落形成，这证明疫苗确实已被福尔马林完全灭活。此外，还将制备好的灭活疫苗用PBS洗涤三次，然后稀释，最终使细菌浓度达到3×10? CFU/mL。接着向鱼体内注射200微升的疫苗，以便进一步检测
讨论
本研究探讨了含有福尔马林灭活的维罗尼气单胞菌以及作为凝集素佐剂的刀豆球蛋白A的疫苗配方，通过腹腔注射的方式在尼罗罗非鱼体内发挥的免疫保护作用。研究结果有力地证明了，刀豆球蛋白A能够通过增强先天性和适应性免疫反应，显著提高鱼类在面临病原体侵袭时的抵抗力。
非特异性免疫标志物也有显著升高
结论
通过腹腔注射含有刀豆球蛋白A佐剂的福尔马林灭活维罗尼气单胞菌疫苗，能够显著激发尼罗罗非鱼的先天性和适应性免疫反应。该疫苗是安全的，它不仅提升了溶菌酶、髓过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，还提高了天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶和碱性磷酸酶等代谢酶的活性，同时血清IgM水平也有所上升。此外，TCR-β、IgM、MHC-II等基因的表达也出现了上调现象
CRediT作者贡献说明
里塔姆·古哈：撰写——初稿、验证、软件应用、资源提供、方法设计、研究实施、正式分析、数据整理。伊卡波尔·旺卡哈特：撰写——审阅与编辑、验证、资源提供、项目管理、研究实施、正式分析、数据整理。普里塔姆·埃卢马莱：撰写——审阅与编辑、监督工作、项目管理、资金申请、概念构思。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
作者们衷心感谢喀拉拉邦科钦科技大学海洋科学学院海洋生物学、微生物学和生物化学系的卓越水产疫苗研发中心所提供的宝贵支持，正是这些设施使得本研究得以顺利开展。作者RG还特别感谢DST-INSPIRE项目提供的奖学金支持（编号IF230205）。
资金支持
作者RG和EP对DST-INAE [2023/IN-TW/07]项目提供的资金支持表示深切感谢。作者RG还获得了DST INSPIRE奖学金的支持，编号为IF230205。
里塔姆·古哈|伊卡波尔·旺卡哈特|普里塔姆·埃卢马莱
印度喀拉拉邦科钦市682016，科钦科技大学海洋科学学院海洋生物学、微生物学和生物化学系
