虚拟文库对接识别具有镇痛活性的神经降压素受体小分子激动剂

《Nature Communications》：Docking of virtual libraries identifies small-molecule agonists of neurotensin receptors with analgesic activity

　　

肽激活的G蛋白偶联受体（GPCRs）在多种疾病中发挥关键作用，但由于开发小分子药物面临挑战，仍是难以攻克的治疗靶点。在此，研究人员探索基于结构的策略以识别神经降压素（NTS）受体的小分子激动剂，这些激动剂有望开发非阿片类镇痛药。首先基于受体-肽复合物设计类药分子的化学文库，然后将1450万个化合物通过计算对接至NTS1受体的正构结合位点。合成了39个排名靠前的化合物，其中7个经实验证实能激活NTS1受体。结构指导的优化产生了信号特征与内源性肽不同的NTS1配体，这些化合物还对NTS2受体表现出高亲和力。两个激动剂与NTS1受体结合的高分辨率晶体结构确认了预测的结合模式，并揭示了激活的关键决定因素。在体内，这些化合物在啮齿动物中产生强效抗伤害作用而不引起低血压，与NTS2受体活性的贡献一致。为了促进该虚拟筛选方法更广泛地应用于肽结合GPCRs，研究人员提供了包含数十亿个易于合成化合物的定制化学文库。

**神经降压素受体小分子激动剂的虚拟筛选与结构优化：从计算设计到体内镇痛活性**

**研究背景与问题**
G蛋白偶联受体（GPCRs）是人类最大的膜蛋白家族，介导多种生理信号，约34%的已批准药物靶向GPCRs。然而，在超过100个被肽类激活的GPCRs中，由于小分子药物开发难度大——肽类配体代谢稳定性差、膜通透性低，而小分子难以模拟大肽激动剂的功能——许多成员仍未被充分利用为药物靶点。神经降压素受体（NTSRs，包括NTS1R和NTS2R两个亚型）是治疗疼痛、神经退行性疾病和精神疾病的潜在靶点，尤其有望开发非阿片类镇痛药。尽管内源性激动剂神经降压素（NTS）具有强效镇痛作用，但其肽类性质导致药代动力学差、无法有效穿透血脑屏障。过去三十年间，仅发现少量NTSR小分子配体，且尚无小分子NTSR激动剂进入临床试验。因此，亟需开发高效策略以发现肽结合GPCRs的小分子激动剂。本研究基于结构设计，旨在加速NTSR小分子激动剂的发现，并评估其镇痛潜力。

**研究概述与主要发现**
研究人员通过结构指导的虚拟筛选，从两个定制化学文库（共1450万个化合物）中鉴定出NTS1R小分子激动剂，经合成、功能筛选和结构优化获得高效化合物，并解析了受体-激动剂复合物晶体结构。这些化合物表现出与内源性肽不同的信号特征，对NTS2R具有高亲和力，并在啮齿动物疼痛模型中产生强效镇痛作用而不引起低血压。该研究发表于《Nature Communications》。

**关键技术方法**
1. **虚拟文库设计与分子对接**：基于NTS1R与肽片段NTS_8–13的晶体结构，分析关键相互作用（如C端亮氨酸的锚定），设计两种文库：（1）多样文库（ZINC数据库中的阴离子化合物，820万个）；（2）聚焦文库（通过酰胺键连接亮氨酸的商业构建块，630万个）。使用DOCK3.7程序将1450万个化合物对接至人NTS1R（hNTS1R）正构结合位点，经聚类和视觉检查选择39个化合物合成。
2. **体外功能筛选与优化**：通过IP1积累实验检测G_q活性，鉴定7个活性化合物；对先导化合物24和25进行多轮结构优化（使用Suzuki偶联、四唑缩合等虚拟库），合成35个和60个类似物，最终获得高效激动剂28a、30a和35a。
3. **晶体结构解析**：将优化的NTS1R变体（NTSR1–H4X）与激动剂复合，在脂质立方相中结晶，使用X射线衍射解析至3.1 ?分辨率，确定结合模式和激活机制。
4. **体内药效与药代动力学**：在大鼠福尔马林疼痛模型和甩尾试验中评估镇痛活性，使用选择性NTS2R拮抗剂（NTRC844）验证受体亚型参与；通过静脉注射监测血压，并通过LC-MS/MS测定血浆、脑脊液和脑组织中的化合物浓度（样本来自Sprague-Dawley大鼠）。
5. **信号通路分析**：使用BRET生物传感器检测G_q、G_i、G_s蛋白激活及β-arrestin-2招募，并利用NanoBRET结合实验评估正构激动剂对变构调节剂SBI-553衍生物（PJ125）结合的影响。

**研究结果**
**1. Design of chemical libraries tailored for neurotensin receptors**
研究人员分析大鼠NTS1R（rNTS1R）与NTS_8–13及小分子激动剂RTI-3a的晶体结构，发现C端亮氨酸的羧酸根与R327^6.54形成盐桥、与Y146^3.29形成氢键，是激活关键。基于此，从ZINC数据库构建含820万个阴离子化合物的多样文库，以及通过酰胺偶联构建含630万个C端亮氨酸化合物的聚焦文库，后者覆盖了更相关的化学空间。

**2. Structure-based docking for NTS1R agonists**
使用DOCK3.7将两个文库的1450万个化合物对接至hNTS1R正构位点（基于rNTS1R-RTI-3a结构，PDB: 6ZA8），经聚类和视觉检查，从多样文库和聚焦文库分别选出23个和16个化合物进行合成。

**3. Functional screening of designed compounds**
通过IP1积累实验检测化合物对hNTS1R的G_q活性。多样文库中仅化合物1有弱活性（EC₅₀=47 μM），而聚焦文库中6个化合物（24–29）激活受体，其中24和25活性最强（EC₅₀=1.9和4.5 μM，E_max>80%），其亮氨酸通过酰胺键连接至六元芳香环，分别占据Ile12和Tyr11口袋。

**4. Structure-guided optimization**
对化合物24进行优化：通过Suzuki偶联虚拟库探索5-甲基噻吩-2-基的替换，但未提高活性；通过四唑缩合虚拟库优化四唑环上的取代基，获得化合物28a（EC₅₀=0.15 μM，E_max=101%）、29a和30a，其芳香取代基与Tyr11酚环重叠，活性和效力优于参考激动剂SRI-9829。将亮氨酸替换为金刚烷基得到35a，仍保持部分激动活性（EC₅₀=0.44 μM，E_max=81%），表明该骨架可调节功效。

**5. Signaling signatures of small-molecule agonists**
通过BRET检测G_q、G_i1激活和cAMP积累（G_s），以及PathHunter和BRET检测β-arrestin-2招募。28a和30a为G_q和G_i1完全激动剂（E_max>100%），但抑制G_s信号（IC₅₀>30 μM）；35a为G_q强部分激动剂（E_max=86%），G_i1弱部分激动剂（E_max=31%），并完全抑制G_s（IC₅₀=5.0 μM）。所有化合物均促进β-arrestin-2招募，且35a效力最高（EC₅₀=1.6 μM）。这些信号特征与内源性肽NTS_8–13不同。

**6. Agonist-dependent binding of an allosteric modulator to NTS1R**
NanoBRET实验显示，28a、30a、35a增强了变构配体PJ125（源于SBI-553）的结合，E_max为50–89%，而RTI-3a无显著增强，表明正构激动剂可差异调节变构位点。

**7. Complex structures of NTS1R with compounds 28a and 30a confirm the predicted agonist binding modes**
解析NTSR1–H4X与28a和30a的复合物晶体结构（3.1 ?），确认亮氨酸与R327^6.54和Y145^3.29的相互作用，以及苯环和甲基噻吩的占据模式。计算预测总体正确，但对接模型在取代基方向和张力上有偏差（RMSD 2.4–2.6 ?）。

**8. Molecular basis of full and partial partial agonism**
比较28a/30a与RTI-3a的结构：RTI-3a的氯喹啉基团与H348^7.32形成Cl-π相互作用，稳定ECL2和ECL3，导致TM7 N端外移1–3 ?；而28a/30a的甲基噻吩使H348、H132、W339、F344侧链无序，更接近NTS_8–13复合物的TM6/TM7倾斜，与其完全激动活性相关。

**9. Identified ligands show high affinity and selectivity for the NTS2R subtype**
竞争结合实验显示，28a、30a、35a对hNTS1R的K_i为7.9–55 μM，但对hNTS2R的K_i为22–690 nM（选择性达360倍），对rNTS2R的K_i为8–22 nM。功能实验（IP1生成）在NTS2R敲除小鼠心脏组织中确认其激动活性。对μOR、κOR、δOR、5-HT_1A、α_2A和APJ受体的结合显示化合物35a对hNTS2R选择性>600倍。

**10. Analgesic activity of selective high-affinity NTS2R agonists**
在大鼠福尔马林疼痛模型中，鞘内注射28a、30a、35a（1200 nmol/kg）显著减少炎症期伤害行为。甩尾试验中，28a产生时间依赖性镇痛，该效应被非选择性NTSR拮抗剂SR142948A和选择性NTS2R拮抗剂NTRC844完全阻断，证实NTS2R介导。静脉注射28a、30a、35a不引起低血压，而NTS_8–13导致显著降压。药代动力学显示28a血浆半衰期2.8 h，脑脊液和脑组织浓度低于检测限，表明其外周分布。

**11. Ultra-large chemical libraries tailored for peptide-binding receptors**
分析ChEMBL中83个肽结合GPCRs的配体，发现84%为肽类，非肽配体中144个含末端氨基酸，与内源性激动剂锚定残基对应（如血管紧张素、阿片、ghrelin受体）。基于此，研究人员构建了AANCHOR库（含47亿个基于N端或C端氨基酸的化合物，可商业合成），并公开提供以促进其他靶点的虚拟筛选。

**总结与结论**
讨论部分指出，本研究通过结构指导的虚拟筛选成功鉴定了NTSR小分子激动剂，主要发现包括：（1）聚焦文库设计显著提高了命中率（38% vs 4%），该方法可推广至其他肽结合GPCRs；（2）结构优化揭示了功效差异的分子基础——小分子与正构位点的精细平衡决定完全/部分激动活性，且信号特征（如G_q/G_i激活、G_s抑制）与内源性肽不同；（3）低纳摩尔亲和力的NTS2R选择性化合物在体内产生镇痛作用且无低血压副作用，为开发非阿片类镇痛药提供了起点。研究结论可翻译为：本研究通过基于结构的虚拟筛选，从两个定制化学文库中鉴定出NTS1R小分子激动剂，经结构优化获得信号特征与内源性肽不同的NTS1配体，其中对NTS2R具有高亲和力和选择性的化合物在啮齿动物中产生镇痛作用而不引起低血压，为开发治疗疼痛的新型药物提供了起点。