《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Decoding the regulatory genome: single-cell four-omics integration
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在近期发表于《自然》的一项研究中，Chen等人介绍了CHARM（单细胞染色质构象、组蛋白修饰、染色质可及性与RNA表达多组学分析平台），该平台在同一细胞核内同时捕获四种调控模态。研究人员通过整合策略，为解析多个表观遗传调控层次如何在单细胞分辨率下协同控制基因表
在近期发表于《自然》的一项研究中，Chen等人介绍了CHARM（单细胞染色质构象、组蛋白修饰、染色质可及性与RNA表达多组学分析平台），该平台在同一细胞核内同时捕获四种调控模态。研究人员通过整合策略，为解析多个表观遗传调控层次如何在单细胞分辨率下协同控制基因表达提供了全面框架。真核细胞中的基因调控受分子与空间机制的复杂相互作用支配。染色质可及性决定启动子和增强子等调控元件是否可供转录因子结合；组蛋白修饰定义促进或抑制转录的染色质状态；同时，基因组三维结构建立远端调控元件与靶基因之间的空间邻近性。尽管每个调控层次已被广泛研究，但理解它们如何在同一细胞内协同运作仍是一大挑战。先前技术已为单一模态提供重要见解：ATAC-seq分析染色质可及性，CUT&Tag捕获组蛋白修饰，Hi-C揭示三维基因组结构。近期单细胞平台如ChAIR和scHiCAR可联合分析染色质可及性、RNA和三维接触，但其三维接触捕获锚定于可及染色质或候选顺式调控元件，导致染色质结构重建出现结构性偏差。此外，这些平台未捕获的调控模态（如组蛋白修饰）需单独分析并通过计算整合进行跨模态分析。CHARM通过增加组蛋白修饰作为第四种同细胞模态并使用基于限制性内切酶的Hi-C，实现了更少偏差的染色质结构重建，弥补了这一空白。该方法在同一细胞核内同时捕获四种关键调控模态，保留了染色质结构、表观遗传状态与转录输出之间的天然关系。研究基于先前的多组学策略，将染色质标记、邻近连接和逆转录整合为统一工作流程，从而无需对不同细胞中单独分析的模态进行计算整合，但生物重复、批次或样本间的整合仍需单独考虑（图1）。
**论文解读：单细胞四组学整合揭示调控基因组的协同机制**
**研究背景与问题**
真核生物基因表达调控涉及多个层次：染色质可及性决定调控元件（如启动子和增强子）的可及性；组蛋白修饰（如H3K27me3抑制性标记和H3K27ac激活标记）调节染色质状态；三维基因组结构使远端调控元件与靶基因在空间上靠近。尽管这些层面各自被深入研究，但它们如何在同一细胞内协同运作仍不清楚。传统单细胞技术通常仅捕获一或两种模态，例如ATAC-seq（染色质可及性）、CUT&Tag（组蛋白修饰）或Hi-C（三维接触）。近期平台如ChAIR和scHiCAR虽可联合分析三种模态，但局限于可及染色质或候选顺式元件，导致三维结构重建存在偏差，且无法同时捕获组蛋白修饰。因此，迫切需要一种能够无偏地同时捕获多种调控模态的技术，以揭示基因调控的完整图景。该研究旨在开发CHARM平台，通过在同一细胞核内整合染色质构象、组蛋白修饰、染色质可及性和RNA表达，直接解析多模态调控的协同机制。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
**研究内容与结论**
研究人员开发了CHARM（单细胞染色质构象、组蛋白修饰、染色质可及性与RNA表达多组学分析平台），并在小鼠胚胎干细胞（mESCs）和小鼠皮质组织中进行验证。结果表明：CHARM能以单细胞分辨率同时获取四种模态的高质量数据，每个细胞平均检测到185万Hi-C接触、103,765个H3K27me3片段、52,302个ATAC片段和17,163个RNA UMIs，与已有数据集高度一致。通过分析细胞周期轨迹，发现染色质可及性在分裂后以复制时间依赖性方式恢复，而H3K27me3则更均匀地重建，表明活跃和抑制性染色质状态受不同机制调控。三维基因组重建揭示了可及染色质形成离散空间簇，富集超级增强子和转录共激活因子，簇内基因表现出协调转录活性。在皮质组织中，CHARM鉴定出89,076个候选远端增强子-启动子连接，并通过可解释机器学习框架（Shapley值分解）进一步筛选出16种细胞类型中7,146个高置信度连接，其中Ndnf/Lamp5中间神经元特有的连接数量最多。多模态整合模型比单模态模型更准确地预测基因表达，其中H3K27ac预测能力最强，但所有模态结合效果最佳。
**关键技术方法**
CHARM平台的核心技术包括：基于Tn5转座酶的标签化（标记可及染色质和组蛋白修饰抗体）、原位Hi-C（限制性内切酶消化后邻近连接）、逆转录（捕获RNA）以及条形码标记（区分不同模态）。样本来源为小鼠胚胎干细胞（mESCs）和成年小鼠皮质组织。
**研究结果**
**1. CHARM平台性能验证**
通过将CHARM数据与已知数据集对比，发现其所有模态的灵敏度与特异性均达到或优于先前方法。例如，在Sox2基因座，可检测到启动子和增强子区域的开放染色质及连接两者的染色质环；在Hoxd基因簇则观察到H3K27me3富集的抑制性染色质域，证实平台能同时捕获活跃和抑制性调控状态。
**2. 细胞周期中表观遗传状态的继承**
分析单细胞轨迹发现：染色质可及性在分裂后以复制时间依赖性方式恢复，而H3K27me3的恢复更均匀且与复制时间无关。三维染色质组织影响后者的恢复效率——与H3K27me3富集区域空间邻近的位点更快恢复抑制性标记，表明空间结构参与表观遗传记忆的维持。
**3. 三维调控枢纽**
从单细胞Hi-C重建的三维结构显示，可及染色质区域形成离散空间簇，这些簇富集超级增强子和转录共激活因子（如Mediator复合体），簇内基因转录活性更高。此外，H3K27me3标记的区域与可及染色质部分共定位，提示存在双价染色质，维持发育基因的待激活状态。
**4. 细胞类型特异性增强子-启动子连接**
在小鼠皮质中，CHARM通过同时分析H3K27ac、染色质可及性、染色质环和转录组，鉴定出16种细胞类型特异的调控连接。例如，Gad2基因座：抑制性神经元共享一组远端元件形成长程染色质环，而Ndnf/Lamp5中间神经元则额外增加一个增强子，形成嵌套式调控结构。通过多模态相关性分析得到89,076个候选连接，进一步用Shapley值分解筛选出7,146个高置信度连接，其中Ndnf/Lamp5中间神经元连接最多。
**5. 多模态预测模型**
构建可解释机器学习模型，比较不同模态对基因表达的预测能力。单独使用染色质可及性、H3K27ac或染色质环时，H3K27ac预测能力最强；但整合所有模态的模型性能最佳，说明转录受多层调控协调驱动。
**总结与讨论**
研究结论：CHARM平台能够以单细胞分辨率同时捕获染色质构象、组蛋白修饰、染色质可及性和RNA表达，揭示多模态调控的协同机制。染色质可及性与组蛋白修饰在细胞周期中以不同方式恢复，三维空间结构参与表观遗传记忆维持。可及染色质形成功能性的三维调控枢纽，促进基因协同表达。细胞类型特异性增强子-启动子连接通过多模态整合和机器学习得到精确鉴定，其中H3K27ac是最强预测因子，但多模态整合效果最佳。该研究为理解基因调控网络提供了高分辨率工具，并指出未来需发展更复杂的计算策略以解析高维多组学数据。
