益生菌干酪乳杆菌通过肠道菌群-丁酸盐-HDAC/NF-κB信号改善类风湿关节炎免疫微环境

《Gut Microbes》：Probiotic Lactobacillus casei improves immune microenvironment in rheumatoid arthritis via gut microbiota-butyrate-HDAC/NF-κB signaling

　　

类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以持续性滑膜炎症、进行性关节破坏和功能残疾为特征。新出现的证据表明，肠道菌群失调和宿主蛋白糖基化在RA进展过程中调节免疫信号中发挥重要作用。在本研究中，研究人员证明益生菌干酪乳杆菌（L. casei）调节肠道微生物组成并增强丁酸盐产生，从而影响HDAC/NF-κB信号和O-GlcNAc糖基化。L. casei的给药显著减轻了关节炎症状和滑膜损伤，降低了血清炎症细胞因子水平，重构了肠道微生物群结构，并增强了丁酸盐产生。此外，L. casei通过下调O-GlcNAc糖苷酶（OGA）活性，显著增加了关键免疫信号蛋白（如STAB1）的O-GlcNAc酰化。重要的是，L. casei还调节了组蛋白去乙酰化酶（HDAC）表达并抑制了NF-κB通路激活，协同促进了糖基化介导的抗炎效应。本研究提供了证据表明，L. casei通过共同改善关节免疫微环境和减轻炎症反应，减轻了滑膜炎症并有助于类风湿关节炎的免疫稳态。

**论文解读：益生菌干酪乳杆菌通过肠道菌群-丁酸盐-HDAC/NF-κB信号改善类风湿关节炎免疫微环境**

**研究背景与问题**
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以持续性滑膜炎症、进行性关节破坏和功能残疾为特征，全球RA治疗市场预计到2025年达339.6亿美元。其病理机制涉及异常免疫激活，促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）和免疫细胞驱动滑膜炎症和骨破坏。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）通过去乙酰化组蛋白和非组蛋白，调控基因转录和信号转导，RA滑膜中HDAC1/2高表达与炎症因子升高、成纤维样滑膜细胞（FLS）增殖及关节破坏相关；HDAC通过NF-κB、STAT3、MAPK通路放大炎症信号，其抑制剂可缓解炎症并抑制FLS侵袭，成为有前景的表观遗传治疗靶点。肠道菌群失调也参与RA发病，表现为有益菌（如普拉梭菌、双歧杆菌、乳杆菌）减少，潜在病原菌（如柯氏普雷沃菌、迟缓埃格特菌）增多，破坏肠道屏障、增加通透性，促进脂多糖（LPS）和瓜氨酸化蛋白易位，触发全身性炎症。微生物代谢产物（如短链脂肪酸SCFAs、胆汁酸、吲哚衍生物）调节T细胞分化、巨噬细胞极化和NF-κB信号。O-GlcNAc糖基化（一种可逆的翻译后修饰PTM）在RA中与磷酸化相互作用，特别是NF-κB p65（RelA）上的O-GlcNAc修饰增强其核转位和DNA结合，导致TNF-α、IL-1β、IL-6持续表达，促进滑膜增殖和炎症。干酪乳杆菌（L. casei）具有抗炎作用，可调节T细胞平衡、增强黏膜屏障，并通过重塑肠道菌群增加SCFAs（如丁酸盐），进而调节O-GlcNAc糖苷酶（OGA）活性，维持O-GlcNAc动态平衡，将代谢与免疫联系起来。然而，系统探索L. casei通过肠道-关节轴调节宿主糖基化和HDAC/NF-κB信号改善RA的机制研究有限。本研究旨在阐明这一多层面网络。

**研究开展与结论**
研究人员利用胶原诱导关节炎（CIA）小鼠模型，结合临床样本队列（30例RA患者和30例健康对照HC），通过16S rRNA基因测序、O-GlcNAc糖基化蛋白质组学、Western blot、免疫组化、流式细胞术、细胞迁移实验、siRNA敲低等技术，系统评估了L. casei对RA的作用。结果表明，L. casei通过重塑肠道菌群、增加丁酸盐产生，抑制HDAC/NF-κB信号和TLR4/MyD88通路，并上调O-GlcNAc修饰（如STAB1蛋白），协同改善关节免疫微环境，减轻滑膜炎症和骨破坏。该研究为益生菌干预RA提供了新机制，论文发表在《Gut Microbes》。

**主要关键技术方法**
研究人员从山西中医药大学动物中心获取C57BL/6J小鼠（SPF级，雄性，6周龄），并收集山西中医药大学附属医院30例RA患者和30例HC的粪便及血液样本。采用16S rRNA基因测序（V3-V4区，Illumina NovaSeq 6000平台）分析肠道菌群；利用O-GlcNAc单克隆抗体（CTD110.6）富集O-GlcNAc酰化肽段，结合4D-Label-free LC-MS/MS（timsTOF Pro质谱）进行糖基化蛋白质组学；通过Western blot、免疫组化、免疫荧光检测蛋白表达；使用流式细胞术分析FLS凋亡；通过siRNA（脂质体转染）敲低STAB1；采用气相色谱（GC）定量丁酸盐；利用Micro-CT评估骨侵蚀；使用IVIS小动物活体成像监测炎症信号。

**研究结果**
**1. 患者与健康受试者肠道菌群差异及基线数据收集**
通过比较30例RA患者和30例HC的粪便菌群，发现RA患者中抗炎菌属粪杆菌（Faecalibacterium）相对丰度显著降低，α多样性（Observed-species、Shannon、Simpson指数）显著降低，β多样性（PCoA和NMDS）呈现明显分离。LEfSe分析显示RA患者产SCFAs菌（如乳杆菌、青春双歧杆菌、粪丁酸菌、罗斯氏菌）减少，致病菌（如Enterocloster aldenensis、Hungatella、Parvimonas micra）增加。随机森林分析鉴定出多个产SCFAs菌属差异显著。L. casei丰度在RA患者中显著降低（p<0.001），且与类风湿因子（RF）呈强负相关，与促炎细胞因子呈负相关，表明其调节免疫平衡的作用。

**2. 干酪乳杆菌定植显著减轻RA症状**
在CIA小鼠模型中，L. casei治疗28天后，爪肿胀度和厚度显著降低，H&E染色显示炎症浸润、成纤维细胞增生、新生血管、软骨破坏和血管翳明显减轻，Mankin和OARSI评分改善。Masson染色显示胶原沉积和关节损伤减轻。Micro-CT显示骨侵蚀部分缓解。IVIS成像显示关节炎症荧光信号显著降低，表明L. casei通过调节肠道-关节轴减轻关节炎症和骨破坏。

**3. 干酪乳杆菌逆转肠道菌群失调**
16S rRNA测序显示，CIA组厚壁菌门（Firmicutes）和乳杆菌（Lactobacillus）减少，而L. casei高剂量组（L. casei-H）使其恢复，并增加阿克曼菌（Akkermansia），减少有害菌普雷沃菌（Prevotella）和脱硫弧菌（Desulfovibrio）。α多样性（Pielou_e和Simpson指数）和β多样性（PCoA和NMDS）在组间显著差异。LEfSe分析显示CIA小鼠产SCFAs菌（如巨单胞菌Megamonas）减少，致病菌增加；L. casei-H组富集产丁酸菌（如丁酸球菌Butyricicoccus和粪球菌Pullicaecorum）。PICRUSt2和MetaCyc通路分析表明SCFAs代谢通路增强，BIOCYC数据库重建显示丙酮酸可发酵生成丁酸和丙酸，提示L. casei通过调节菌群结构和功能促进SCFAs产生。

**4. 干酪乳杆菌通过恢复黏膜屏障功能和抑制炎症反应减轻关节炎**
扫描电镜（SEM）显示CIA小鼠结肠绒毛丢失、上皮损伤和孔隙形成，L. casei治疗改善绒毛完整性，球菌和杆菌黏附于黏膜表面。Western blot显示L. casei显著增加紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达，抑制炎症信号蛋白TLR4、TRAF6和MyD88。AB/PAS染色显示CIA小鼠杯状细胞减少和酸性黏液分泌异常，L. casei减轻这些变化。H&E染色显示结肠结构损伤和炎症浸润改善。免疫组化显示MUC2表达在CIA组降低，L. casei组显著增加，表明化学和免疫屏障功能增强。

**5. 干酪乳杆菌抑制HDAC/NF-κB信号通路蛋白并调节相关炎症因子**
Western blot显示，与CIA组相比，L. casei显著降低滑膜组织中HDAC1、HDAC2、p65及磷酸化p65水平，抑制HDAC/NF-κB信号。免疫共沉淀（Co-IP）显示L. casei降低TLR4与MyD88的相互作用，抑制下游信号。划痕实验显示L. casei以剂量依赖性方式抑制FLS迁移。免疫荧光和鬼笔环肽染色显示L. casei减弱炎症激活和细胞骨架重塑。流式细胞术显示TSA（HDAC抑制剂）和PDTC（NF-κB抑制剂）均增加FLS凋亡，L. casei与PDTC联合处理进一步降低凋亡。Western blot证实L. casei联合TSA或PDTC更强抑制HDAC1、HDAC2、p65和磷酸化p65。丁酸盐（But）单独处理也显著降低这些蛋白，联合TSA/PDTC抑制作用更强，表明丁酸盐是重要功能介质。

**6. O-GlcNAc蛋白质组学**
利用结肠组织进行O-GlcNAc蛋白质组学分析，鉴定出32个差异O-GlcNAc修饰肽段（22个上调，10个下调）。基序分析显示修饰位点位于丝氨酸和苏氨酸，富集于细胞信号结构域。亚细胞定位显示相应蛋白主要定位于细胞核。GO富集分析表明参与细胞组分维持和突触结构，分子功能涉及启动子特异性DNA结合。结构域注释富集锌指C2H2型。位点分布分析发现STAB1苏氨酸2046存在保守O-GlcNAc修饰，可能参与细胞黏附和信号转导。

**7. 糖基化数据库分析与相关蛋白**
利用GEO数据库（GSE77298，来自荷兰RA队列，16例RA患者和7例HC的滑膜转录组数据）分析，发现STAB1高表达RA患者DAS28评分和IL-6水平显著高于HC，且两者与STAB1表达正相关，提示STAB1为潜在诊断靶点。Western blot证实CIA小鼠中STAB1蛋白表达增加，OGA表达升高，L. casei降低OGA表达。在FLS细胞中，L. casei联合OGA抑制剂Thiamet G进一步增强O-GlcNAc修饰并调节炎症信号蛋白。CETSA分析显示CIA小鼠NF-κB p65热稳定性降低，提示异常O-GlcNAc修饰影响其转录活性。siRNA敲低STAB1增强NF-κB信号活性，丁酸盐抑制该信号，且丁酸盐部分减弱STAB1敲低效应，表明STAB1与丁酸盐功能性相互作用调节炎症。

**8. 干酪乳杆菌联合丁酸盐调节RA炎症通路和组织损伤**
气相色谱显示L. casei-H组粪便丁酸盐水平升高。进一步分组实验显示，L. casei联合丁酸盐（But）处理显著降低CIA小鼠中IKKα/β、IκBα及其磷酸化水平，抑制NF-κB信号。H&E染色显示关节和结肠病理改变（滑膜增生、炎症浸润、软骨破坏、绒毛损伤）在联合治疗组得到最有效缓解。免疫组化证实核P-p65表达降低。综上，L. casei联合丁酸盐协同抑制NF-κB信号，改善关节和肠道病理。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，RA相关的肠道菌群失调不仅改变微生物组成，也影响系统代谢功能和免疫调节能力，将肠道从共生稳态环境转变为炎症促进环境。本研究聚焦于肠道菌群、代谢产物、翻译后修饰和炎症信号通路之间的多层次调控网络。L. casei通过调节菌群代谢产物（丁酸盐）影响O-GlcNAc修饰水平，增加UDP-GlcNAc供应，并抑制HDAC/NF-κB信号，恢复肠道屏障功能，抑制TLR4/MyD88信号，从而减少全身性炎症信号传递。丁酸盐作为天然HDAC抑制剂，独立调节HDAC和NF-κB相关分子，与L. casei协同增强抗炎效应。研究局限性包括需结合GPR受体阻断和菌群丁酸盐耗竭干预以精确定义丁酸盐贡献，以及O-GlcNAc与其他修饰的动态相互作用需进一步临床样本验证。结论：本研究提供了证据表明，L. casei通过改善关节免疫微环境和减轻炎症反应，减轻滑膜炎症并有助于RA免疫稳态。