利用短乳杆菌作为微生物纳米工厂可持续生产多功能银纳米颗粒

《International Journal of Nanomedicine》：Harnessing Levilactobacillus brevis as a Microbial Nanofactory for the Sustainable Production of Multifunctional Silver Nanoparticles

　　

摘要：利用益生菌绿色合成银纳米颗粒（AgNPs）已成为一种生产具有增强生物医学潜力的多功能纳米材料的可持续策略。在本研究中，研究人员将从生牛奶中分离并通过GenBank登录号PZ476340下的16S核糖体核糖核酸（16S rRNA）基因测序鉴定的益生菌短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）用作AgNP生物合成的生物还原和稳定剂。通过特征性颜色变化初步确认纳米颗粒形成，随后使用紫外-可见（UV–Vis）光谱法、傅里叶变换红外光谱法（FTIR）、透射电子显微镜（TEM）、选区电子衍射（SAED）和Zeta电位分析进行表征。通过2,2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）自由基清除抗氧化试验、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）细胞毒性试验、体外划痕伤口愈合试验以及基于凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）的抗凝血试验，评估了生物合成AgNPs的生物活性。UV–Vis光谱法在约410 nm处显示出一个明显的表面等离子体共振峰，证实了AgNPs的形成。FTIR分析表明细胞外蛋白和多糖参与了纳米颗粒的还原和表面包覆，而TEM和SAED分析显示主要为球形、结晶性纳米颗粒，尺寸范围为7至55 nm，平均直径为27.18 ± 12.7 nm。Zeta电位分析得出值为-2.57 mV，表明静电稳定性较弱；然而，FTIR数据表明胶体稳定性主要通过来自短乳杆菌代谢物的生物分子包覆层提供的空间位阻维持。该纳米颗粒表现出强浓度依赖性抗氧化活性，在1000 μg/mL时达到79.7%的DPPH自由基清除率，半数抑制浓度（IC₅₀）为61.4 μg/mL。MTT试验显示对Vero正常肾上皮细胞、MCF-7人乳腺癌细胞和HepG2人肝细胞癌细胞系存在显著剂量依赖性细胞毒性，IC₅₀值分别为110.29、81.28和102.64 μg/mL，并伴有明显的形态学改变。体外划痕试验显示中等伤口愈合活性，48小时后伤口闭合率约为34.5%。此外，AgNPs通过延长PT和APTT表现出抗凝血活性，表明其与凝血途径存在相互作用。总之，这些发现表明短乳杆菌可作为高效微生物纳米工厂，用于环境友好型合成多功能AgNPs。纳米级尺寸、结晶结构和生物分子表面功能化的结合，共同促成了显著的抗氧化、细胞毒性、伤口愈合和抗凝血活性，突显了益生菌介导的纳米技术在生物医学和治疗应用中的潜力。

**论文解读：利用短乳杆菌作为微生物纳米工厂可持续生产多功能银纳米颗粒**

**研究背景**

纳米技术通过设计和制造具有独特理化性质的纳米材料，彻底改变了材料科学和生物医学领域。这些纳米材料，特别是金属纳米颗粒，因其高比表面积、可调光学特性、增强的催化活性以及与生物系统精确靶向互动的能力，在药物递送、诊断、抗菌治疗和组织工程等领域展现出巨大潜力。银纳米颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌、抗炎、抗氧化和促进伤口愈合等生物活性而备受关注。然而，传统的AgNPs物理和化学合成方法通常需要高能耗、专用仪器和有毒还原剂，这引发了关于环境影响、细胞毒性和临床生物相容性的担忧。此外，通过这些方法合成的纳米颗粒可能存在聚集、稳定性差和生物活性不佳的问题。为了克服这些局限性，利用生物系统（如植物、真菌、藻类和微生物）的绿色合成策略应运而生，成为一种可持续、经济且可扩展的替代方案。微生物，特别是益生菌，因其生长迅速、代谢多样且能分泌胞外生物分子以促进纳米颗粒形成和稳定，成为高效的纳米生物工厂。尽管已有研究探索了多种乳杆菌和双歧杆菌用于纳米颗粒生物合成，但特定益生菌株如短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）在合成兼具抗氧化、细胞毒性/抗癌、伤口愈合和抗凝血等多种功能AgNPs方面的潜力尚未被系统研究。此外，慢性伤口常伴随止血障碍和长期炎症，而AgNPs被报道不仅能通过抗菌和抗氧化机制促进伤口愈合，还能与凝血因子相互作用，调节凝血途径。因此，开发一种能同时促进组织修复并防止病理性血栓形成的多功能纳米材料具有重要临床意义。这项研究旨在填补这一知识空白，利用短乳杆菌作为生物还原和稳定剂，绿色合成AgNPs，并全面评估其多功能生物医学潜力。该论文发表在《International Journal of Nanomedicine》。

**主要技术方法**

研究人员为开展此研究，主要采用了以下关键技术方法：首先，从埃及乡村地区的生牛奶样本中分离乳酸菌（LAB），通过革兰氏染色、过氧化氢酶试验等表型测试进行初步筛选，并利用16S rRNA基因测序进行分子鉴定，鉴定菌株为短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）。其次，利用短乳杆菌的无细胞培养上清液作为生物还原和稳定剂，在温和条件下与硝酸银（AgNO₃）溶液反应，生物合成AgNPs。随后，对合成的AgNPs进行全面的物理化学表征，包括使用紫外-可见（UV-Vis）光谱法分析其光学性质，傅里叶变换红外光谱法（FTIR）鉴定表面官能团，透射电子显微镜（TEM）和选区电子衍射（SAED）观察形貌、尺寸和晶体结构，以及Zeta电位分析评估胶体稳定性。最后，通过一系列体外实验评估其生物活性，包括DPPH自由基清除实验评估抗氧化活性，MTT实验评估对Vero正常肾上皮细胞、MCF-7人乳腺癌细胞和HepG2人肝细胞癌细胞的细胞毒性/抗癌活性，体外划痕实验评估伤口愈合活性，以及基于凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（APTT）的实验评估抗凝血活性。

**研究结果**

**分离、初步表征和分子鉴定：** 通过形态学观察、革兰氏染色、过氧化氢酶阴性等表型特征，从生牛奶中初步筛选出具有潜在益生特性的乳酸菌分离株。这些分离株在pH 2.0和0.3%胆盐条件下表现出高存活率（51.3% ± 1.2%）和生长效率（64.7% ± 2.5%），表明其具有耐受胃肠道恶劣环境的潜力。最具潜力的分离株经16S rRNA基因测序和BLAST分析，与短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）标准菌株的序列相似性高达99.78%，因此被鉴定为短乳杆菌（GenBank登录号：PZ476340）。

**银纳米颗粒的合成：** 将短乳杆菌的无细胞培养上清液与AgNO₃溶液混合后，反应混合物颜色从浅黄色逐渐变为深棕色，这是AgNPs形成的典型视觉特征，表明菌株分泌的胞外生物分子（如蛋白质、酶、多糖等）成功将银离子（Ag⁺）还原为金属银纳米颗粒（Ag⁰）。

**物理化学表征：**
* **UV-Vis光谱分析：** 观察到AgNPs悬浮液在约410 nm处有一个明显的表面等离子体共振（SPR）吸收峰，这是球形银纳米颗粒的典型特征，其非对称性表明存在一定程度的粒径多分散性。
* **FTIR和TEM分析：** FTIR光谱显示，在1633 cm^-1（酰胺I带）和~1050 cm^-1（C-O伸缩振动）等处有强吸收峰，证实了来自短乳杆菌的胞外蛋白和多糖等生物分子参与了纳米颗粒的还原、表面包覆和稳定。TEM图像显示，AgNPs主要为球形，尺寸范围为7-55 nm，平均直径为27.18 ± 12.7 nm。SAED图案显示清晰的同心衍射环，证实了纳米颗粒的面心立方（fcc）晶体结构。
* **Zeta电位分析：** AgNPs的Zeta电位为-2.57 mV，表明其表面带有弱负电荷。虽然这一绝对值较低，表明静电稳定性有限，但FTIR分析证实了表面存在致密的生物分子包覆层，该包覆层通过空间位阻效应维持了纳米颗粒的胶体稳定性。

**生物活性评估：**
* **抗氧化活性：** DPPH自由基清除实验显示，AgNPs表现出浓度依赖性的抗氧化活性。在1000 μg/mL浓度下，清除率达到79.7%，IC₅₀值为61.4 μg/mL。其抗氧化活性归因于银核与表面生物分子（含羟基、胺基等基团）的协同作用。
* **细胞毒性/抗癌活性：** MTT实验结果表明，AgNPs对Vero、MCF-7和HepG2细胞均表现出显著的剂量依赖性细胞毒性。其对MCF-7细胞的IC₅₀值（81.28 μg/mL）低于Vero细胞（110.29 μg/mL），表明对癌细胞具有相对更高的选择性。形态学观察证实了细胞损伤、皱缩和脱落等细胞毒性特征。
* **伤口愈合活性：** 体外划痕实验显示，AgNPs处理48小时后，伤口闭合率为34.53%，低于未处理对照组的64.37%，表明其表现出中等的伤口愈合活性。这可能与测试浓度下的细胞毒性效应有关，但渐进式的伤口闭合仍表明其具有促进细胞迁移和修复的潜力。
* **抗凝血活性：** PT和APTT实验表明，AgNPs能浓度依赖性地延长凝血时间。在75 μg/mL浓度下，PT从约14秒延长至约20秒，APTT从约28秒延长至约52秒。这表明AgNPs能同时干扰内源性和外源性凝血途径，其作用机制可能涉及与血浆蛋白（如纤维蛋白原、凝血酶）的相互作用。虽然其抗凝血效果弱于肝素，但结果仍具有显著意义。

**总结与讨论**

研究人员成功利用从生牛奶中分离鉴定的短乳杆菌作为生物纳米工厂，通过绿色合成方法制备了多功能银纳米颗粒。该合成过程温和、环保，无需使用有毒化学试剂。合成的AgNPs具有球形、结晶性好、粒径在纳米级别（7-55 nm）的特点，并因表面覆盖有菌株分泌的蛋白和多糖等生物分子而获得稳定性。这些物理化学特性共同赋予了AgNPs显著的生物活性：其抗氧化活性源于纳米尺寸和表面生物分子的电子/氢供体能力；其细胞毒性主要通过诱导活性氧（ROS）产生、引发线粒体功能障碍和凋亡通路实现，并且对癌细胞表现出一定的选择性；其抗凝血活性则通过延长PT和APTT来体现，表明其能干扰凝血级联反应。研究结论翻译如下：本研究证明了利用益生菌短乳杆菌作为生物还原和稳定剂进行AgNPs绿色合成的成功，突出了其作为可持续微生物纳米工厂进行纳米颗粒生产的潜力。生物合成的AgNPs通过UV-Vis光谱、FTIR、TEM、SAED和Zeta电位分析成功表征。纳米颗粒在410 nm处显示出特征性的SPR峰，主要为球形、结晶结构，粒径范围为7到55 nm，平均直径为27.18 ± 12.7 nm。尽管测得的Zeta电位（-2.57 mV）表明静电稳定性较弱，但FTIR分析证实了存在一个生物分子包覆层，该层可能通过空间效应促进了胶体稳定性。生物学评估显示，合成的AgNPs具有多功能活性。纳米颗粒表现出强浓度依赖性抗氧化活性，针对MCF-7和HepG2癌细胞系的显著细胞毒性和抗增殖效应，在划痕实验中的中等伤口愈合活性，以及通过延长PT和APTT凝血时间而体现的可测量的抗凝血效果。这些生物学特性很可能与纳米级尺寸、结晶银核以及来自短乳杆菌代谢物的表面相关生物分子的共同影响有关。重要的是，本研究填补了关于利用短乳杆菌生物合成多功能AgNPs的知识空白，并扩展了支持益生菌介导的纳米技术作为传统纳米颗粒合成方法的环境友好型替代方案的证据。尽管体外研究结果显示了令人鼓舞的生物医学潜力，但需要进一步研究来阐明潜在的分子机制，优化纳米颗粒的稳定性和剂量，评估对正常细胞和癌细胞的选择性，并通过体内研究确认其安全性和有效性。总之，本研究确立了短乳杆菌来源的AgNPs作为有前景的多功能纳米材料，在生物医学、制药和治疗领域具有潜在应用。