烈性噬菌体vB_PmuP_Pa7裂解多杀性巴氏杆菌的机制：来自链特异性转录组分析的见解

《Microorganisms》：Mechanism of Pasteurella multocida Lysis by Virulent Phage vB_PmuP_Pa7: Insights from a Strand-Specific Transcriptome Analysis

　　

烈性噬菌体vB_PmuP_Pa7是控制多杀性巴氏杆菌感染的有前景的候选者，然而其裂解过程的分子基础仍知之甚少。在此，研究人员对感染Pa7的多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）S34在0、20、30和120分钟时进行了链特异性RNA测序（strand-specific RNA sequencing），以表征噬菌体-宿主转录动力学。分别在20、30和120分钟检测到234、433和558个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），表明感染过程中宿主进行渐进式重编程。主成分分析（principal component analysis，PCA）、表达分布分析和样本相关性分析证实了明显的阶段特异性转录转变。基因本体论（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析表明，Pa7感染与翻译、核糖体功能、ABC转运蛋白（ABC transporters）、氨基糖和核苷酸糖代谢、细菌趋化性以及三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）的变化相关。选择了四个涉及转运、碳水化合物代谢和翻译相关功能的代表性差异表达基因进行逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）分析。RT-qPCR结果显示与RNA测序（RNA sequencing，RNA-seq）衍生的表达模式存在部分、基因和时间点依赖的一致性。综上所述，这些发现提供了Pa7感染的时间分辨转录谱，并识别出可能与感染过程和细菌细胞裂解相关的宿主通路。然而，这些基因和通路的直接功能贡献仍有待实验确定。

**研究背景与问题**
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）是一种宿主范围广泛的重要动物病原菌，可导致牛、牦牛、猪和家禽的呼吸道疾病、败血症及继发感染，在全球畜牧业中造成持续经济损失。在高海拔牧区，该菌与牦牛出血性败血症和牛呼吸道疾病密切相关，成为区域动物健康防控的重点目标。长期以来，抗生素是控制多杀性巴氏杆菌感染的主要策略，但临床和养殖场中长时间、高剂量及不合理的抗菌药物使用加速了耐药菌株的出现和传播，降低了治疗效果，增加了疾病控制难度。多杀性巴氏杆菌及其他革兰氏阴性菌的耐药性涉及β-内酰胺酶产生、膜通透性降低、外排泵活性和靶位修饰等多种机制，这些机制削弱了抗菌药物疗效，使牲畜细菌性呼吸道感染的控制更加复杂。在此背景下，噬菌体（bacteriophage）——能特异性识别并裂解细菌的天然病毒——重新获得广泛关注。与抗生素相比，裂性噬菌体具有宿主特异性高、感染部位自我扩增、对共生菌群干扰有限以及与抗生素协同作用的潜力。近年来，噬菌体鸡尾酒、噬菌体-抗生素组合及噬菌体工程化研究稳步推进，使噬菌体疗法从概念验证向更实际的转化应用迈进。对于多杀性巴氏杆菌等动物病原菌，噬菌体不仅可作为替代抗菌剂，还有助于疫苗研发、伴随诊断和生物防治策略。然而，以往研究多集中于噬菌体分离及表型或基因组特征描述，而多杀性巴氏杆菌对噬菌体感染的分子响应，尤其是转录组水平的变化，仍知之甚少。因此，时间分辨的链特异性RNA测序（RNA-seq）为表征裂解周期不同阶段宿主转录重编程、识别与噬菌体诱导细菌裂解相关的通路提供了机会。

**研究内容与结论**
本研究使用链特异性转录组学系统揭示了烈性噬菌体vB_PmuP_Pa7（以下简称Pa7）对多杀性巴氏杆菌S34的阶段依赖性转录重编程。研究人员对感染Pa7的宿主菌在0、20、30和120分钟四个时间点进行链特异性RNA-seq，共检测到234、433和558个差异表达基因（DEGs），表明感染过程中宿主转录资源被逐步接管。主成分分析（PCA）和相关性分析显示，0分钟与早期感染样本聚类紧密，而120分钟样本明显分离，提示噬菌体感染将宿主驱动至不同的分子状态。GO和KEGG富集分析表明，Pa7感染主要扰乱翻译、核糖体结构、碳水化合物代谢、跨膜转运、ATP结合和DNA结合等基本功能模块；在通路层面，核糖体、ABC转运蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢、细菌趋化性及三羧酸循环（TCA cycle）是最突出的共同富集条目。通过RT-qPCR验证了四个代表性DEGs（涉及转运、碳水化合物代谢和翻译相关功能），结果与RNA-seq表达模式存在部分一致性。基于这些数据，研究人员构建了转录组指导的工作模型，概括了Pa7感染期间宿主主要通路的变化。该研究提供了Pa7感染的时间分辨转录组图谱，识别出与翻译、转运、能量代谢和细胞包膜前体代谢相关的宿主候选通路，为后续机制研究和应用导向的探索奠定了分子基础。论文发表在《Microorganisms》。

**关键技术方法**
研究人员采用的主要技术方法包括：链特异性RNA测序（strand-specific RNA-seq）用于获取宿主在感染0、20、30和120分钟的时间分辨转录组数据；差异表达基因（DEG）分析使用edgeR软件，以|log₂FC| > 1和FDR < 0.05为阈值；功能富集分析通过Goatools和KOBAS进行GO和KEGG通路富集；RT-qPCR用于验证四个代表性DEGs的表达模式。样本来源：宿主菌株P. multocida S34（牦牛源荚膜血清B型）及其对应烈性噬菌体vB_PmuP_Pa7均由青海大学传染病实验室分离保存。感染模型在MOI=10下建立，采样时间点基于Pa7的一步生长曲线确定。

**研究结果**
**3.1 噬菌体vB_PmuP_Pa7操控宿主菌S34的转录系统**
通过对四个时间点12个样本进行转录组测序，经严格质控后，所有样本Q20和Q30均高于98.04%和93.75%，错误率低于0.025%，GC含量稳定。清洁读数比对至宿主参考基因组，比对率在34.93%至63.41%之间。感染后期宿主比对率下降，可能由噬菌体转录本增加、宿主RNA降解及细胞裂解导致。当使用宿主-噬菌体联合参考基因组进行比对时，噬菌体来源读数比例随感染进程增加，支持Pa7感染使转录群体从宿主主导转向噬菌体相关RNA的生物学解释。

**3.2 感染期间基因表达模式的全局分析**
PCA显示对照组（0分钟）与晚期上升期（120分钟）样本明显分离，而潜伏期（20分钟）和早期上升期（30分钟）样本沿第一主成分紧密聚集，表明宿主对噬菌体感染产生阶段特异性转录重编程。基因表达概率密度分布显示0分钟与20分钟曲线几乎一致，30分钟与120分钟峰值模式相似且区别于早期阶段，提示感染后期出现高表达基因群体。样本相关性分析证实生物学重复间高度可重复，早期与晚期感染样本间相关性较低，强化了阶段性转录变化。

**3.3 噬菌体感染诱导的差异表达基因时间动态**
以|log₂FC| > 1和FDR < 0.05为阈值，在感染各阶段相对于对照组鉴定DEGs。DEG数量随感染进程逐步增加：潜伏期（20分钟 vs 0分钟）234个（116上调，118下调），早期上升期（30分钟 vs 0分钟）433个（184上调，249下调），晚期上升期（120分钟 vs 0分钟）558个（224上调，334下调）。维恩分析和差异表达分析揭示了各组间共有和特有DEGs，共鉴定出54个上调DEGs和58个下调DEGs。热图聚类将样本分为四个簇，表明宿主对噬菌体感染的响应是一个动态复杂过程，涉及不同基因模块的时序调控。

**3.4 差异表达基因的功能富集分析**
GO分析显示DEGs显著富集于“翻译”、“碳水化合物代谢过程”和“跨膜转运”等生物学过程，以及“ATP结合”、“核糖体结构组成”和“DNA结合”等分子功能。早期阶段DEGs主要与基础细胞过程和代谢相关，中后期DEGs更多涉及转录调控活性和应激反应。KEGG通路分析进一步揭示，共同显著富集的核心通路包括核糖体、ABC转运蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢、细菌趋化性及TCA循环。核糖体和翻译相关术语的富集提示Pa7感染与宿主蛋白质合成机制显著扰动相关。ABC转运蛋白和TRAP转运蛋白的变化可能反映营养摄取改变、膜相关生理重塑和应激适应。氨基糖和核苷酸糖代谢的富集可能与细胞包膜前体代谢变化相关，尤其对多杀性巴氏杆菌而言，荚膜和脂多糖等表面结构对细菌生理和宿主互作至关重要。TCA循环的改变进一步表明感染期间能量代谢受影响，可能反映噬菌体复制带来的代谢负担增加和宿主细胞稳态逐渐丧失。不同时间点深入分析显示，核苷酸合成和能量代谢相关通路在感染早期显著激活，而细胞壁/膜合成及应激反应相关通路在后期变化更大。

**3.5 关键功能基因的鉴定与实验验证**
基于差异表达和功能富集分析，选择四个代表性DEGs进行RT-qPCR验证：DR93_RS03530（TRAP转运蛋白通透酶）、DR93_RS01060（ABC转运蛋白底物结合蛋白）、DR93_RS04575（半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶）和DR93_RS01265（30S核糖体蛋白S17）。RT-qPCR与RNA-seq结果在部分基因-时间点比较中显示相似方向或时间模式，而其他比较在表达幅度和/或时间模式上存在差异，尤其在感染后期。因此，RT-qPCR结果为选定的RNA-seq表达变化提供了靶向支持，但一致性水平因基因和时间点而异，不应视为对所有DEGs的全面验证。

**3.6 转录组指导的Pa7感染期间宿主响应工作模型**
基于链特异性转录组数据，研究人员构建了工作模型，概括Pa7感染期间主要宿主通路的变化。Pa7感染与翻译和核糖体功能、跨膜转运、氨基糖和核苷酸糖代谢、细菌趋化性及TCA循环相关基因的时间依赖性变化有关。四个RT-qPCR验证基因分别代表转运蛋白、碳水化合物代谢和核糖体相关功能。由于RNA-seq与RT-qPCR之间的一致性因基因和时间点而异，且本研究未包含功能基因扰动、蛋白质水平验证、代谢物测量或通路活性直接评估，该模型应视为假设生成性总结，而非细菌裂解的已证实因果机制。

**总结与讨论**
讨论部分指出，本研究通过链特异性转录组学揭示了Pa7对多杀性巴氏杆菌S34的阶段依赖性转录重编程。随着感染从潜伏期进展至早期上升期和晚期上升期，宿主转录组显著变化，DEG数量持续增加，表明Pa7并非仅在一个时间点扰动宿主，而是在整个裂解周期中逐步接管宿主转录资源。PCA和相关性分析进一步支持了阶段特异性模式，与其它裂性噬菌体系统的“早期-中期-晚期”时序程序高度一致。GO和KEGG分析表明Pa7感染主要扰乱翻译、核糖体、碳水化合物代谢、跨膜转运等基本功能模块，核糖体、ABC转运蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢、细菌趋化性和TCA循环是最突出的共同富集通路。这提示Pa7介导的裂解并非单纯的破坏过程，而是噬菌体首先重塑宿主蛋白质合成和转运网络以重新分配细胞资源支持自身复制。ABC转运系统的反复出现提示其可能是Pa7重编程宿主代谢和膜稳态的主要切入点。细菌趋化性相关通路的显著变化表明宿主在感染期间可能改变运动、粘附和环境感知能力，从而影响噬菌体吸附后的下游响应。四个RT-qPCR验证基因的结果为选定的转录变化提供了靶向支持，但一致性有限。研究局限性包括：结论主要基于RNA水平证据，缺乏蛋白质组学、代谢组学和功能敲除实验的交叉验证；当前使用高MOI同步感染模型，可能更适合揭示“理想化”感染过程，在自然低MOI、非同步和宿主微环境条件下的解释需谨慎；Pa7的受体识别、DNA注入、复制控制和裂解执行模块尚未系统解析。未来研究应整合时间分辨蛋白质组学、代谢组学、基因编辑和动物感染模型，以验证Pa7如何重塑宿主代谢和防御网络，并评估其在牦牛或其他反刍动物中的实际应用。

**研究结论**
本研究表征了感染烈性噬菌体vB_PmuP_Pa7期间多杀性巴氏杆菌S34的时间分辨转录变化。Pa7感染与翻译、核糖体功能、转运、碳水化合物代谢、细胞包膜前体代谢及能量代谢相关宿主通路的变化相关联。四个选定基因的RT-qPCR分析为RNA-seq衍生的表达模式提供了部分支持，一致性水平因基因和时间点而异。这些结果识别出供未来功能研究的候选宿主基因和通路，但本身并不证明所识别的通路因果性地介导噬菌体复制或细菌裂解。本研究为后续Pa7感染的机制和应用导向研究提供了转录组框架。